红三叶响应淹水胁迫的相关通路及差异表达基因分析_尚盼盼.pdf
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1、第 32 卷第 4 期Vol.32,No.4112-1282023 年 4 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA尚盼盼,曾兵,屈明好,等.红三叶响应淹水胁迫的相关通路及差异表达基因分析.草业学报,2023,32(4):112128.SHANG Pan-pan,ZENG Bing,QU Ming-hao,et al.Analysis of metabolic pathways and differentially expressed genes of Trifolium pratense respondingto waterlogging stress.Acta Prat
2、aculturae Sinica,2023,32(4):112128.红三叶响应淹水胁迫的相关通路及差异表达基因分析尚盼盼1,曾兵1,屈明好1,李明阳1,杨兴云1,郑玉倩1,沈秉娜1,毕磊1,杨成1,曾兵1,2*(1.西南大学动物科学技术学院,重庆 402460;2.草食动物科学重庆市重点实验室,重庆 400715)摘要:淹水胁迫是影响植物生长发育和分布的重要非生物胁迫,对植物淹水胁迫的研究是解决近年来极端强降水天气下植物生产管理的关键。红三叶作为优质豆科牧草,耐淹性较差,长期水淹会导致烂根死亡。为研究红三叶淹水胁迫下的分子响应机理,本研究通过 Illumina高通量测序平台,以耐涝型品种“红
3、龙”淹水胁迫下 0、8 和 24 h 三个时间点的幼苗叶片为材料进行转录组测序,将测序数据与参考基因组比对后进行差异表达基因(DEGs)分析和功能注释。结果显示,与对照 0 h相比,“红龙”在淹水胁迫 8 h后,有 5065个 DEGs,其中,上调表达基因 2442个,下调表达基因 2623个;在淹水胁迫 24 h后,有 9022个 DEGs,其中,上调表达基因 4279个,下调表达基因 4743个。基因本体数据库富集结果显示,DEGs 主要富集于代谢过程、细胞过程、生物调节、细胞、催化活性等条目;东京基因与基因组数据库富集结果显示,DEGs显著富集于植物激素信号调节、植物-病原互作、碳代谢和
4、乙醛酸及二羧酸代谢等通路中,其中乙醛酸及二羧酸代谢通路中过氧化氢酶和甲酸脱氢酶等抗氧化酶相关基因高表达;并且发现差异表达的 AP2/ERF、WRKY、bHLH、NAC、bZIP 等重要转录因子在红三叶响应淹水胁迫中也发挥重要作用。最后利用qRT-PCR对 DEGs进行表达模式的分析验证,发现其与 RNA-Seq结果一致,证实了测序结果的准确性。本研究根据转录组信息对 DEGs展开功能注释、代谢通路、转录因子等方面的分析研究,初步了解红三叶对淹水胁迫的分子响应机理,为后续候选基因功能挖掘提供了基础数据和理论支撑。关键词:红三叶;淹水胁迫;转录组测序;代谢通路;差异表达基因Analysis of
5、metabolic pathways and differentially expressed genes of Trifoliumpratense responding to waterlogging stressSHANG Pan-pan1,ZENG Bing1,QU Ming-hao1,LI Ming-yang1,YANG Xing-yun1,ZHENG Yu-qian1,SHEN Bing-na1,BI Lei1,YANG Cheng1,ZENG Bing1,2*1.College of Animal Science and Technology,Southwest Universit
6、y,Chongqing 402460,China;2.Chongqing Key Laboratory ofHerbivore Science,Chongqing 400715,ChinaAbstract:Waterlogging stress is an important abiotic stress that affects plant growth,development and distribution,and research on plant waterlogging stress is key to addressing plant production management
7、under extreme heavyrainfall in recent years.Trifolium pratense is a high-quality legume forage,but is poorly tolerant to waterlogging,and long-term waterlogging can lead to root rot and death.In order to investigate the molecular response mechanismof T.pratense under waterlogging stress,the transcri
8、ptome was sequenced from seedling leaves of the waterlogging-tolerant variety“Hong Long”at 0,8 and 24 h using an Illumina high-throughput sequencing platform,and theDOI:10.11686/cyxb2022139http:/收稿日期:2022-03-30;改回日期:2022-05-13基金项目:中央高校基本科研业务费项目荣昌专项(XDJK2020RC001),重庆市现代山地特色高效农业产业技术体系(草食牲畜)2023和西南大学大学
9、生创新训练项目(X202210635042;X202210635203)资助。作者简介:尚盼盼(1996-),女,甘肃定西人,在读硕士。E-mail:1916001864 通信作者 Corresponding author.E-mail:第 32 卷第 4 期草业学报 2023 年sequenced data were compared with the reference genome for differentially expressed genes(DEGs)and functionalannotation.The results showed that,compared with t
10、he control 0 h,“Hong Long”had 5065 DEGs after 8 h ofwaterlogging stress,among which 2442 genes were up-regulated and 2623 genes were down-regulated;After 24 h ofwaterlogging stress,there were 9022 DEGs,among which 4279 genes were up-regulated and 4743 genes weredown-regulated.The gene ontology(GO)en
11、richment results showed that DEGs were mainly enriched in terms ofmetabolic process,cellular process,biological regulation,cell and catalytic activity;The kyoto encyclopedia ofgenes and genomes(KEGG)enrichment results showed that DEGs were significantly enriched in pathways such asplant hormone sign
12、al transduction,plant-pathogen interaction,carbon metabolism and glyoxylate and dicarboxylatemetabolism,in which antioxidant enzymes such as peroxidase and formic dehydrogenase were highly expressed in theglyoxylate and dicarboxylate metabolism pathways.This study also found that the differentially
13、expressed AP2/ERF,WRKY,bHLH,NAC,bZIP and other important transcription factors also played important roles in theresponse of T.pratense to waterlogging stress.Finally,the expression pattern of DEGs was verified by qRT-PCRand found to be consistent with the RNA-Seq results,confirming the accuracy of
14、the sequencing results.In thisstudy,functional annotation,metabolic pathways and transcription factors of DEGs were analyzed based on thetranscriptome information,which provided a preliminary understanding of the molecular response mechanisms of T.pratense to waterlogging stress and provided basic d
15、ata and theoretical direction for the subsequent functional miningof candidate genes.Key words:Trifolium pratense;waterlogging stress;transcriptomic sequencing;metabolic pathways;differentiallyexpressed genes红三叶(Trifolium pratense)是豆科三叶草属多年生草本植物,又名红车轴草、红荷兰翘摇,喜温暖湿润气候,耐旱性较差,耐湿性良好,适合在年降水量较充沛的地方生长,但红三叶不
16、耐淹,长期水淹会烂根死亡。其营养价值和药用价值高,富含黄酮类物质、蛋白质、氨基酸等成分1-3。具有适口性好、易消化、再生速度快、鲜草产量高等特点。因此,在国内外被广泛种植和利用2。红三叶中含有黄酮和异黄酮类物质,有研究表明,岷山红三叶青干草中异黄酮含量约为大豆(Glycine max)籽粒中异黄酮含量的 10倍4-5,是妇女保健产品和药用产品中异黄酮类物质提取的重要原料6。作为优质豆科牧草,红三叶在土壤肥力建设和种植制度中发挥多重效益,并且在青贮时对蛋白质的利用率明显高于紫花苜蓿(Medicago sativa),作为牧草的物种多样性对不同的气候和耕作系统也起重要作用7,是英国、美国、新西兰等
17、地重要的栽培牧草之一,在我国西南、西北、华中、新疆等地也均有分布8。淹水胁迫是植物遭受的主要非生物胁迫之一,与其他非生物胁迫共同决定了植物的特定结构和分布9-10。近年来我国多地受强降水的影响,2021年河南省、重庆市等地暴发的持续性强降水天气最大时降水量高达 201.9mm,长期的涝害严重破坏植物的自然分布规律,直接影响生物多样性11,并且会对作物生长和粮食安全产生毁灭性的影响12。而淹水胁迫的共同特征是使植物周期性或长期性处于厌氧或缺氧的状态,其中缺氧胁迫是最主要的影响因子13。当植物受到淹水胁迫时,会立刻响应缺氧生境,并采取积极的应对措施9。有研究表明,植物通过感知体内氧浓度的降低和乙烯
18、含量升高两条途径来响应淹水胁迫14。变化的氧气(oxygen,O2)、二氧化碳(carbon dioxide,CO2)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、乙烯(ethylene,ET)作为信号诱导植物适应缺氧胁迫过程15,这些信号引起植物代谢途径下调,减少氧气消耗。植物通过改变叶片形态、促进伸长生长、形成通气组织和不定根等形态结构来适应淹水胁迫16。同时,淹水胁迫也诱导了乙醇和乳酸发酵、乙烯合成、乙烯信号转导、细胞程序性死亡、细胞壁松弛等相关基因的上调表达17。我国对淹水胁迫下植物的形态结构、生理生化代谢等相应机理已有较清晰的认识,但研究对象以粮食作物和模式植物
19、为主。113Vol.32,No.4ACTA PRATACULTURAE SINICA(2023)随着高通量测序技术的发展与成熟,对植物逆境胁迫的研究已全面进入功能基因组学阶段18。近年来,对红三叶抗旱性19-20、抗白粉病21、重金属胁迫22相关的研究相对较多,但淹水胁迫方面未见报道。基于转录组学来研究淹水胁迫下植物转录组的发生和变化规律,可以从整体水平来研究基因的功能及结构,从而解析特定生物学过程中基因转录调控规律及分子机制23。红三叶作为优质豆科牧草,不耐水淹,若长期水淹会造成烂根死亡。因此,为分析红三叶淹水胁迫下的分子响应机理,本研究以课题组前期淹水胁迫转录组分析为基础24-26,选取红
20、三叶耐淹型品种“红龙”,以 0 h为对照,淹水胁迫 8和 24 h为处理的 3个时间点的幼苗叶片为材料进行转录组测序,结合生物信息分析对获得的转录组数据进行差异表达基因筛选,并对差异表达基因开展功能注释、代谢通路、转录因子等方面的分析研究,以分析其对淹水胁迫的分子响应机理,并为后续研究提供基础数据和理论支撑。1材料与方法1.1试验材料与方法本试验以课题组前期通过耐涝试验筛选得来的红三叶耐涝型品种“红龙”(H)为材料,材料来源于北京百斯特草业有限公司,于 2021年 4月培养于西南大学牧草实验室。育苗前将种子放入高锰酸钾溶液中浸泡一段时间,再播种于装有体积比为营养土蛭石珍珠岩=3 1 1的育苗托
21、盘中,将其放入培养箱中,温度设置为 22/15 (昼/夜),相对湿度 80%,光照 10000 lx,光周期 16 h/8 h(昼/夜),每 2 d浇 1次水,待长至 5 cm 时移栽至花盆中,每盆定株 15株。培养至幼苗期,待掌状三出复叶长至约 2cm,叶面上出现 V形白斑时进行淹水胁迫处理。试验采用盆栽淹水胁迫,将生长良好且长势一致的盆栽红三叶全部放入水箱(长 80 cm宽 57 cm高 50cm)中,加水淹没植株,并保持水位一直没过植株顶部。淹水胁迫开始后,分别于淹水胁迫处理 0、8 和 24 h时采用混样法剪取叶片(每个时间点 3个生物学重复),在液氮中迅速冷冻,后置于-80 冰箱保存
22、备用,用于后续测序分析。1.2试验流程1.2.1样品 RNA 提取与转录组测序为获得淹水胁迫下“红龙”品种红三叶差异表达基因,使用 Trizol试剂盒(Invitrogen公司,美国)分别对淹水 0、8和 24 h时采取的红三叶幼苗叶片进行总 RNA提取,利用 Nanodrop 1000分光光度计(Thermo scientific 公司,美国)和 Agilent 2100 分析仪(Agilent Technologies 公司,美国)检测 RNA 样品的纯度、浓度和完整性。对检测合格的样品进行 cDNA文库构建,并在 Illumina平台进行测序。1.2.2测序数据质量控制将测得的原始数据进
23、行过滤:1)去除含有接头的序列;2)去除低质量的序列(包括去除 N 的比例大于 10%的序列;去除质量值 Q10的碱基数占整条序列 50%以上的序列)27。将得到的高质量数据以红三叶基因组为参考进行序列比对及后续分析。参考基因组下载地址为:ftp:/ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/000/583/005/GCA_000583005.2_Tp1.0/GCA_000583005.2_Tp1.0_genomic.fna.gz。利用StringTie对比对上的 reads进行组装和定量分析28。1.2.3差异表达基因分析与功能注释统计好基因表达量之后,分别对对
24、照组 0 h和处理组 8和 24 h的基因表达状况进行比对,找出差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并通过进一步筛选选择差异显著的基因。对于样品组间的差异,使用 DESeq2 进行差异表达分析29,在 DEGs 检测过程中,将差异倍数1.5 且P0.01作为筛选标准。利用 BLAST 程序对差异表达基因进行如下 7 个数据库的功能注释30,非冗余蛋白质序列数据库(non-redundant protein database,Nr)、蛋白质序列数据库(swiss prot protein database,Swiss-Prot)、真核直系同源基
25、因数据 库(eukaryotic orthologous groups,KOG)、直 系 同 源 蛋 白 数 据 库(cluster of orthologous groups of proteins,COG)、基因本体数据库(gene ontology,GO)、蛋白质家族数据库(protein families database,Pfam)、京都基因和基因组途径数据库百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)31-38,获得各自被注释到的差异基因数量,并进行后续差异基因分析。1.2.4差异表达基因 qRT-PCR 验证为了验证测序数据
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