牦牛肺脏各支气管中EPO的表达差异研究_杨映雪.pdf
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1、942023年 第53卷 第1期青藏高原位于中国西部,平均海拔4 000m以上,是世界上海拔最高的高原。由于海拔高,其气候干燥、空气稀薄,且紫外线辐射强;气温低,年平均温度在0以下,大片地区最暖月平均温度不足10;降雨量少,但雪层深厚,冰川融水量大,因此也是东亚、东南亚和南亚许多大江大河的发源地。青藏高原特殊的地理环境造就了其高寒、低氧、强辐射等气候特征1。牦牛主要分布于我国西部地区3 600m以收稿日期:2022-08-09基金项目:大学生创新训练项目(X202210742294、X202210742299)。作者简介:杨映雪,主要从事动物医学学习。E-mail:通信作者:杨琨,副教授,主要
2、从事高原动物适应性研究。E-mail:上的高原,能适应高原低温缺氧、变化无常的极端天气,被当地农牧民作为主要经济收入来源而饲养,作为青藏高原特有的经济畜种,对当地产业发展具有重要意义2。高原牦牛对疾病具有强耐受性和抵抗力3,同时由于长期的自然选择、优胜劣汰,其对低氧环境有良好的适应性4。现有牦牛品种在生理、生化和形态学上具有稳定的遗传学特征5,是研究高原动物低氧适应性的理想材料。肺脏直接与外界相通,是动物体呼吸系统里最重要牦牛肺脏各支气管中EPO的表达差异研究杨映雪1,贲祖丽1,许瑾1,梁娜1,吴绍米1,杨琨1,2,3*(1.西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730030;2.甘肃省动物
3、细胞技术创新中心,甘肃兰州730030;3.西北民族大学生物医学研究中心,甘肃兰州730030)摘要:为研究促红细胞生成素(EPO)在牦牛肺脏各支气管中的表达差异性,本试验以高原牦牛肺脏作为研究对象,采用H&E染色、免疫组织化学染色的方法,对牦牛肺脏各支气管中EPO的分布与表达差异进行研究。H&E染色结果表明牦牛肺脏组织结构正常;免疫组织化学染色结果显示EPO在各支气管均有表达且黏膜皱襞为强阳性表达,平滑肌层、黏膜下层和外膜呈弱阳性表达。以上结果表明,牦牛肺脏各级支气管中EPO表达程度表现为黏膜上皮细胞强于平滑肌细胞、黏膜下层细胞与外膜细胞;且EPO在各级支气管均有表达,说明EPO对牦牛肺脏低
4、氧适应性具有重要调控作用。关键词:牦牛;肺脏;各级支气管;EPO;表达差异中图分类号:S811.4文献标识码:A文章编号:1006-799X(2023)01-0094-05试验研究DOI:10.15979/62-1064/s.2023.01.0272023年 第53卷 第1期95试验研究的器官,机体对氧气的吸收通过肺脏进行,其在动物适应高原缺氧环境方面起着十分重要的作用6。促红细胞生成素(EPO)是一种激素,由肾皮质肾小管周围间质细胞和肝脏分泌产生,对刺激红细胞生成具有重要作用7。除造血功能之外,EPO在低氧刺激下还表现出多种组织保护作用8。目前对牦牛肺脏或EPO的相关研究虽然较多,但对二者间
5、关系的研究较少。本研究通过H&E染色、免疫组织化学染色的方法,探讨EPO在牦牛肺脏各级支气管的分布与表达情况,为EPO在牦牛肺脏低氧适应性方面提供基本的数据支持。1材料与方法1.1试验材料与处理1.1.1试验材料试验材料取自青藏高原天然牧场的健康成年牦牛。将牦牛屠宰后,取肺脏组织样,并立即用4%多聚甲醛进行固定保存。1.1.2材料处理根据肺脏组织结构,将需要的组织样切为1cm3大小的方块,用组织石蜡包埋法包埋,将其切至5 m厚的组织切片,再进行H&E染色与免疫组织化学染色。1.2试验试剂抗兔SP试剂盒(SP-0023)与多克隆抗体EPO(bs-2343R)均购于北京博奥森生物技术有限公司;DA
6、B染色试剂盒(C02-04001)购自北京索莱宝科技有限公司。其他试剂包括:PBS(磷酸盐缓冲液),0.01mol/L柠檬酸钠缓冲盐,伊红,苏木精,二甲苯,各浓度乙醇。1.3试验方法1.3.1H&E染色将样本按照脱水、透明、浸蜡、包埋的步骤进行处理,并将其制成5 m厚的组织切片,将切片按照烤片、脱蜡、苏木精核染、酸水分化、自来水返蓝、伊红染色、酒精分化、脱水、透明、封片的步骤进行H&E染色,观察其组织结构是否正常。1.3.2免疫组织化学染色将组织切片置于烤片机上,45脱蜡15min后,用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复;切片冷却至室温后,用多克隆抗体(阴性对照则将一抗稀释液换为PBS)在37下孵育2
7、3h,再加入二抗(SP试剂盒B液)进行反应;用PBS缓冲液冲洗后,滴加DAB显色液,显色510min后观察染色程度;苏木精复染2min后,进行酸水分化和自来水冲洗返蓝,并将组织切片脱水、透明、封片后进行镜检。1.3.3图像采集与结果判定把经过H&E染色与免疫组化染色的切片用3%H2O2溶液阻断内源性过氧化物酶,并用封闭液(SP试剂盒A液)进行封闭;在组织切片上滴加1300比例稀释的EPO,反应后置于显微镜照相系统下进行图像采集,并观察分析。免疫组化染色结果有强阳性表达、弱阳性表达和阴性表达3种,3种结果对应的显色效果分别是深棕色、黄棕色、未出现棕黄色或与背景色相似。2结果2.1H&E染色结果如
8、图1所示,经H&E染色后发现该牦牛肺脏各级支气管结构正常,未发现病变。肺内小支气管管腔较大,有明显皱襞,不连续平滑肌束位于固有层下;细支气管管腔变小,皱襞发达且排列紧密;终末细支气管皱襞逐渐消失,平滑肌变为薄薄一层;呼吸性细支气管管壁不完整,管壁由单层纤毛柱状上皮过渡为单层柱状或立方上皮。2.2免疫组织化学染色结果如图2所示,牦牛肺脏小支气管、细支气管、终末细支气管和呼吸性细支气管上均有EPO表达,且黏膜皱襞或黏膜上皮细胞为强阳性表达,呈深棕色;平滑肌层、黏膜下层和外膜为弱阳性表达,呈黄棕色;透明软骨多为阴性表达,与背景颜色相近。总体表达情况呈现962023年 第53卷 第1期出黏膜上皮细胞强
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