SN∕T 5392-2021 苹果牛眼果腐病菌检疫鉴定方法.pdf
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1、I C S6 5.0 2 0.0 1C C S B1 6 3中 华 人 民 共 和 国 检 验 检 疫 行 业 标 准S N/T5 3 9 22 0 2 1 苹果牛眼果腐病菌检疫鉴定方法D e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f N e o f a b r a e a m a l i c o r t i c i s,N e o f a b r a e a p e r e n n a n s,N e o f a b r a e a v a g a b u n d a,N e o f a b r a e a k i e n h o
2、 l z i i2 0 2 1-0 6-1 8发布2 0 2 2-0 1-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国广州海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国黄埔海关、中国检验检疫科学研究院。本文件主要起草人:王卫芳、易建平、魏霜、林慧娇、吕文刚、吴品珊。S N/T5 3 9 22 0 2 1苹果牛眼果腐病菌检疫鉴定方法1 范围 本
3、文件规定了苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定方法。本文件适用于进境苹果和梨等寄主果实、植株中苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件比不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。S N/T 2 4 5 5 进出境水果检验检疫规程3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 苹果牛眼果腐病菌的基本信息4.1 病菌种类4.1.1 腐皮明孢盘菌学名:N e o f a b r a e a m a l i c o r t i c i s(C o r d l e
4、 y)H.S.J a c k s.(1 9 1 3);异名:P e z i c u l a m a l i c o r t i c i s(H.S.J a c k s.)N a n n f.(1 9 3 2)(苹果树炭疽病菌);无性型:C r y p t o s p o r i o p s i s c u r v i s p o r a(P e c k)G r e mm e n(1 9 5 9)。4.1.2 多年生明孢盘菌学名:N e o f a b r a e a p e r e n n a n s K i e n h o l z(1 9 3 9);无 性 型:C r y p t o s p
5、 o r i o p s i s p e r e n n a n s(Z e l l e r&C h i l d s)W o l l e n w.(1 9 3 9)。4.1.3 白明孢盘菌学名:N e o f a b r a e a v a g a b u n d a(D e s m.)R o s s m a n(2 0 1 4);异名:N e o f a b r a e a a l b a(E.J.G u t h r i e)V e r k l e y(1 9 9 9);无性型:P h l y c t e m a v a g a b u n d a D e s m.(1 8 4 7)。4.1
6、.4 金氏明孢盘菌学名:N e o f a b r a e a k i e n h o l z i i(S e i f e r t,S p o t t s&L v e s q u e)S p o t t s,L v e s q u e&S e i f e r t(2 0 1 3);无性型:C r y p t o s p o r i o p s i s k i e n h o l z i i S e i f e r t,S p o t t s&L v e s q u e(2 0 1 0)。4.2 分类地位 真菌界(F u n g i),子囊菌门(A s c o m y c o t a),盘菌亚门
7、(P e z i z o m y c o t i n a),锤舌菌纲(L e o t i o m y c e t e s),1S N/T5 3 9 22 0 2 1锤舌菌亚纲(L e o t i o m y c e t i d a e),柔膜菌目(H e l o t i a l e s),皮盘菌科(D e r m a t a c e a e),明孢盘菌属(N e o f a b-r a e a)。上述四种苹果牛眼果腐病菌的寄主范围、地理分布、侵染传播、症状特点等信息参见附录A。5 方法原理 苹果牛眼果腐病菌的为害症状、病菌的形态特征与培养性状、实时荧光P C R检测结果是制定本标准的主要依据。
8、6 仪器和设备6.1 仪器 生物显微镜、解剖镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平(感量0.0 1 g)、烘箱、灭菌锅、冰箱、恒温孵育仪、制冰机、纯水仪、微波炉、电磁炉、微量移液器(可调式范围:0.5 L1 0 0 0 L)、台式高速离心机、漩涡振荡器、荧光P C R仪、核酸蛋白分析仪。6.2 设备 样品袋、保鲜袋、标签、定性滤纸、放大镜、镊子、解剖刀、棉纱、脱脂棉、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种针、培养皿(直径9 c m)、烧杯、三角瓶、试管、量筒、研钵及研杵、离心管(0.2 mL,1.5 mL,2 mL)及T i p头(0.1 L1 0 L,5 L2 0 0 L,1 0 0 L1 0 0 0
9、L)。7 试剂和材料7.1 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯。无菌双蒸水、无水乙醇、7 0%乙醇、2%C TA B提取缓冲液、1 0%S D S 溶液、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、T r i s-HC l、D NA提取试剂盒、实时荧光P C R通用试剂,引物和探针。7.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(P D A):每1 0 0 0 mL P D A由2 0 0 g去皮马铃薯、2 0 g葡萄糖、1 8 g琼脂配制而成,1 2 1 高压灭菌2 0 m i n。7.3 水果果实 苹果及梨果实。8 检疫鉴定方法8.1 口岸现场查验8.1.1 抽样 口岸现场查验时,按照S N/T 2 4
10、5 5进行抽样与取样。2S N/T5 3 9 22 0 2 18.1.2 果实症状检查 重点查看果实表面、果梗凹部、果萼凹部是否有似牛眼形状的腐烂病斑,用放大镜观察腐烂组织表面是否有稀疏的菌丝体及奶油色胶质状子实体(分生孢子盘)症状特点参见A.4.1和图B.1 a)c)。8.1.3 枝条症状检查 重点查看新梢或枝条、幼树的大枝和主干是否有变色或溃疡病斑,溃疡病斑是否脱落并外露木质部,病健交界树皮组织是否有裂纹,裂纹处是否有子实体(分生孢子盘和子囊盘)症状特点参见A.4.2和图B.1 f)j)。将可疑样品带回实验室进一步检验,记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息。8.2
11、实验室检验8.2.1 直接检验 肉眼观察或镜检病果的外观及剖面症状特点或果树的病梢病枝症状特点,记录病斑的形状、大小、质地及颜色,挑取病部子实体制成玻片,置于生物显微镜下,按8.2.3进行病菌的分离培养,按8.2.4观察病菌的形态特征。8.2.2 保湿培养 如果病果或病枝梢上有明显病状但未形成明显的子实体,进行保湿培养。将可疑病果或病枝梢置于塑料盒或塑料袋中,于2 0 下保湿培养,观察症状的变化,按8.2.3进行病菌分离培养。8.2.3 分离培养 采用组织分离培养法,用7 0%酒精对发病部位及周围组织表面进行喷雾消毒,风干后用消毒过的刀片切取病健交界处果肉组织,切成5 mm5 mm小块后放置于
12、A P D A平板中,或直接挑取病部的子实体,置于A P D A平板上在2 0、黑暗下培养。菌落长出后,挑取菌落边缘的菌丝体,转至P D A平板上纯化培养,纯菌株再转至P D A平板,备用。8.2.4 病菌培养性状和无性型形态特征观察 从纯菌株菌落边缘取直径4 mm菌丝体块,置于P D A平板中央,在2 0、黑暗条件下培养,观察记录菌落的生长速度、颜色变化、子实体的形成和产孢情况。挑取P D A平板上的子实体制成玻片,置于生物显微镜下观察,拍摄分生孢子盘、分生孢子梗、产孢细胞和分生孢子的形态特征。每个菌株测量3 0个分生孢子。8.2.5 有性型形态特征观察 如果病枝梢上已产生病菌的有性型,取病
13、组织进行切片制片,置于生物显微镜下观察记录子囊盘、子囊、子囊孢子的形态特征。8.2.6 致病性测定 该项为首次截获时采用。采用柯赫氏法则验证病菌的致病性。将分离物接种置P D A平板上,于2 0、2 4 h黑暗下培养5 d,用无菌刀片刮取菌落上的分生孢子,用无菌水将稀释成浓度为每毫升11 04个孢子悬浮液。采用7 5%酒精对供试苹果及梨果实进行表面消毒,风干备用。用无菌刀片在靠近3S N/T5 3 9 22 0 2 1果梗凹部果面上划长1 0 mm深2 mm的伤口,将2 5 L分生孢子悬浮液滴入伤口内,对照以无菌水代替孢子悬浮液。每个菌株接种的每个品种果实不少于6个。每个接种果实用保鲜膜单独包
14、装,置于2 0、2 4 h黑暗下保湿培养。每天观察接种果实的发病情况,发病后分离病菌,并完成病菌鉴定的整个程序。8.2.7 实时荧光P C R检测8.2.7.1 D N A提取 病菌基因组D NA的制备方法按照附录C执行。8.2.7.2 实时荧光P C R反应体系和反应程序 实时荧光P C R反应体系和反应程序按照附录D执行。9 鉴定特征9.1 菌落 N e o f a b r a e a m a l i c o r t i c i s,N.p e r e n n a n s,N.v a g a b u n d a和N.k i e n h o l z i i菌落特征相似。在P D A平板上,菌
15、落圆形,边缘规则或不规则,气生菌丝稀少。病菌生长缓慢,菌落初期呈白色至乳白色、浅肉色,后期颜色逐渐加深,呈浅咖啡色、黄褐色至黑褐色,色素不扩散。菌落中有时有浅咖啡色液滴,后期形成深浅褐色相间同心轮纹及奶油色胶质状分生孢子盘 菌落特征参见图B.2 a)。9.2 无性型形态 在病果组织上及P D A 上,可见分生孢子盘,初在寄主表皮下着生,后突出表皮生,枕状,奶油色至发黄,胶质状,常合生,直径0.2 mm1 mm,分生孢子梗无色、瓶梗状,有分枝,产孢细胞无色,(1 01 53)m;分生孢子有大小2 种类型。大分生孢子无色透明,单细胞,培养时偶有2胞3胞,长椭圆形,一端稍小,成熟后有数个细小油球,有
16、时中部有一明显的大油球,N.m a l i c o r t i c i s的大分生孢子较弯曲呈镰刀状至U形,而N.p e r e n n a n s,N.v a g a b u n d a和N.k i e n h o l z i i的分生孢子多数直或稍弯;小分生孢子无色透明,单细胞,长椭圆形,分生孢子两端各有一个较大的油球 种间分子孢子形态差异参见图B.2 b)h),附录E。9.3 有性型形态 有性型非常少见,故该项为参考特征。在发病的枝梢枝干等自然基质上形成,一般在旧分生孢子盘的子座中产生。子囊盘0.5 mm1 mm,直接附着于分生孢子座基部,颜色为灰色到肉色,无柄(偶有短柄);子囊棒状、无
17、盖、基部肉茎很短。子囊孢子8个,无色透明,壁薄,单细胞,椭圆形。随着孢子老熟,子囊孢子变为1隔5隔,子囊孢子壁逐渐增厚,颜色变为淡褐色。除N.k i e n h o l z i i外,N.m a l-i c o r t i c i s,N.p e r e n n a n s,N.v a g a b u n d a均 已 发 现 有 性 型 种 间 子 囊 和 子 囊 孢 子 形 态 差 异 参 见图B.2 i)j),附录E。9.4 致病性测定 该项为首次截获时采用。接种果实产生与苹果牛眼果腐病一致的症状,接种 5 d后,在供试的苹果和鸭梨的接种部位均出现较小的浅褐色病斑,果肉组织软化变褐腐烂;
18、接种后1 0 d,果肉组织腐烂面积扩大,在腐烂组织表面可见少量乳白色胶质状分生孢子盘 接种后发病的症状参见图B.2 d)e)。从发病果实再次分离到的菌株与供试菌株的培养特性及形态特征一致。4S N/T5 3 9 22 0 2 19.5 实时荧光P C R检测 实时荧光P C R检测阈值确定、质控标准及与结果分析按照D.6执行。1 0 结果判定 如果病部有明显的病状和病征,经直接检验,病菌的形态特征与鉴定指标9.2或9.29.3吻合;或如果病部有病状但无病征,经保湿培养和/或分离培养所产生的病菌培养性状及形态特征与鉴定指标9.19.2或9.19.3吻合,判定为苹果牛眼果腐病菌;结合实时荧光P C
19、 R检测结果,判定苹果牛眼果腐病菌的具体种类为N e o f a b r a e a m a l i c o r t i c i s,N.p e r e n n a n s,N.v a g a b u n d a和N.k i e n h o l z i i的其中之一(判断指标按照D.6执行)。1 1 菌种保藏 病菌分离物要标注菌株来源、寄主、分离时间、鉴定人,在含2 0%甘油的冻存管中于-8 0保存,或将菌株转接在P D A斜面上培养,置于4 下保存,并定期转管。保存期满后,需经灭菌处理。1 2 资料保存 妥善保存检验资料,以备复验、谈判和仲裁。检验报告应注明检验日期、方法、结果等,并有检验人
20、签名。检验图片包括症状、病菌培养性状和形态特征图片及实时荧光P C R扩增曲线图等。5S N/T5 3 9 22 0 2 1附 录 A(资料性)苹果牛眼果腐病菌的寄主范围、地理分布、侵染传播、症状特点A.1 寄主范围A.1.1 N e o f a b r a e a m a l i c o r t i c i s和N e o f a b r a e a p e r e n n a n s苹果属(M a l u s)、梨属(P y r u s)、榅桲(C y d o n i a o b l o n g a)、桃(P r u n u s p e r s i c a)、杏(P.a r m e n i
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