论文:基于脂质组学和质谱成像全氟辛酸暴露斑马鱼脂质代谢研究.pdf
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1、硕士学位论文(学术学位论文)基于脂质组学和质谱成像全氟辛酸暴露斑 马鱼脂质代谢研究ANALYSIS OF LIPID METABOLISM IN ZEBRAFISH EXPOSED TO PERFLUOROOCTANOIC ACID BASED ON LIPIDOMICSAND MASS SPECTROMETRYIMAGING万方数据国内图书分类号:0657国际图书分类号:540学校代码:10213密级:公开理学硕士学位论文基于脂质组学和质谱成像全氟辛酸暴露斑马 鱼脂质代谢研究 万方数据Classified Index:0657U.D.C:540Dissertation fbr the Mas
2、ter Degree in ScienceANALYSIS OF LIPID METABOLISM IN ZEBRAFISH EXPOSED TOPERFLUOROOCTANOIC ACID BASED ON LIPIDOMICSAND MASS SPECTROMETRYIMAGING:万方数据哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid,PF OA)是全氟烷基酸家族的一员,因其 优良的稳定性和表面活性,在工业生产中得到广泛应用。目前,PF OA在各种环 境介质中被检测出,尤其广泛分布在水生环境中。止匕外,它们还可以沿食物链转 移和富集,最终高浓度蓄
3、积在人体中。因此,人们越来越关注PF OA暴露对生物 体健康的不利影响。脂质代谢失调是导致许多人类疾病的重要病理原因,研究 PF OA对水生生物脂质代谢的影响及其在生物体内的组织分布对于预测PF OA的 持久性以及对环境和人体的不利影响具有重要意义。目前,关于全氟辛酸对水生 生物脂质代谢的影响缺乏系统研究。斑马鱼直接接触PF OA污染的水体,是评估全氟辛酸对水生生物脂质代谢影 响的理想生物模型。本研究基于脂质组学和解吸电喷雾电离质谱成像(Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging,DESI-MSI)技术 全面揭示全氟
4、辛酸对斑马鱼脂质代谢的影响。脂质组学数据显示,全氟辛酸急性和亚急性暴露,斑马鱼脂质代谢均受到影 响且二者对斑马鱼的脂质毒性机制存在显著差异。在急性暴露实验中筛选出63种 差异性脂质,覆盖三大类脂类,包括甘油磷脂类、鞘脂类、和脂肪酰基类。亚急 性暴露实验中筛选出244种差异性脂质,覆盖四大类脂类,包括甘油磷脂类、鞘 脂类、脂酰酰基类和甘油酯类。PF OA显著影响斑马鱼甘油磷酸代谢,牛磺酸代 谢和鞘磷脂代谢。DESI-MSI数据显示PF OA在斑马鱼体内的富集存在组织异质性,PF OA优先 集中肝脏和脊髓中,后逐渐在斑马鱼肠道,大脑,鳏和肌肉中积累。此外,基于 DESI-MS技术,我们创新性地阐明
5、了 PF OA造成斑马鱼脑部和肠道的脂质代谢紊 乱,具体表现在PF OA急性暴露后斑马鱼脑部硫甘脂和不饱和脂肪酸代谢紊乱,肠道胆汁酸分泌紊乱。关键词:全氟辛酸;脂质组学;质谱成像;斑马鱼万方数据哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractPerfluorooctanoic acid(PF OA)is part of a family of perfluorinated chemicals.Due to unique physicochemical characteristics,such as chemical and thermal inertness,and high surface-a
6、ctive properties,they have been used in a very wide variety of consumer and industrial applications.PF OA has been commonly detected in diverse environments around the world.Most PF OA is released into the aquatic environment,distributed in natural water and organism,and gradually accumulated caused
7、 to high persistence.In addition,they can be transferred and accumulated along food chains.PF OA was found present in the tissues of many species,even in the human body,so there have been raising public concerns over human exposure to PF OA and their adverse health effects.Dysregulation of lipid met
8、abolism is an important pathological cause of many human diseases.Studying the effects of PF OA on lipid metabolism and bioenrichment and tissue distribution in aquatic organisms could give significant predict the persistence of PF OA and insight into effects on the environment and human body.At pre
9、sent,there are few systematic studies on the effects of perfluorooctanoic acid on lipid metabolism in aquatic organisms.At present,there are few systematic studies on the effects of perfluorooctanoic acid on lipid metabolism in aquatic organisms.Zebrafish,as a natural inhabitant of these waters,repr
10、esents an ideal animal model to assess the toxic effects of PF OA.Tn the present study,we employed a system analysis strategy by logistically integrating untargeted lipidomics and Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Imaging(DESI-MSI)to shed light on the mechanisms of lipid toxicity
11、and discover the enrichment characteristics of PF OA in zebrafish.Lipidomics data revealed distinct differences in lipid metabolism that can readily distinguish different doses of PF OA exposure time in zebrafish.Among them,63 differential lipids were screened in the acute exposure experiment,coveri
12、ng Glycerophospholipids(GP),Sphingolipids(SP)and F atty acyls(F A).A total of 244 differential lipids were screened in the subacute exposure experiment,covering GP,SP,F A and Glycerolipids(GL).In addition,PF OA significantly affected the metabolism pathway of taurine,glycerophosphate and sphingomyel
13、in.DESI-MST data showed the enrichment of PF OA in zebrafish with tissue-ii-万方数据哈尔滨工业大学理学硕士学位论文heterogeneity,which is preferentially concentrated in the liver and spinal cord and gradually accumulates in the gut,brain,gills and muscles of the zebrafish.Particularly,based on DESI-MSI technology,we in
14、novatively elucidated that PF OA caused the disorder of lipid metabolism in the brain and intestine,which was manifested in the disorder of sulfatide and unsaturated fatty acids in the brain and the disorder of intestinal bile acid secretion after acute exposure to PF OA.Key words:Perfluorooctanoic
15、acid,Lipidomics,Mass spectrometry imaging,Zebrafish-iii-万方数据哈尔滨工业大学理学硕士学位论文目录摘要.TAbstract.IT第1章绪论.11.1 全氟辛酸污染现状和毒性效应.11.1.1 全氟辛酸在环境中的污染现状.11.1.2 全氟辛酸毒性效应.31.2 脂质和脂质组学概述.61.2.1 脂质简介.61.2.2 脂质组学简介.81.3 质谱成像概述.101.3.1 质谱成像简介.101.3.2 质谱成像在脂质组学的应用.121.4 本研究的研究意义与内容.13第2章实验材料与方法.152.1 实验材料.152.1.1 实验样品.15
16、2.1.2 实验试剂.152.2 实验仪器及装置.152.3 全氟辛酸暴露.162.4 脂质组学分析方法.172.4.1 脂质代谢物提取.172.4.2 脂质组学数据采集.172.4.3 数据处理和分析.182.5 解吸电喷雾电离质谱成像分析方法.192.5.1 冷冻切片的制备.192.5.2 DESI-MSI 数据采集.192.5.3 数据处理与分析.21第3章基于脂质组学技术研究全氟辛酸对斑马鱼脂质代谢的干扰.223.1 引言.223.2 全氟辛酸对斑马鱼脂质的急性毒性.223.2.1 无监督的主成分分析(PCA).22-IV-万方数据哈尔滨工业大学理学硕士学位论文3.2.2 有监督的正交
17、偏最小二乘方-判别分析(OPLS-DA).233.2.3 火山图分析.243.2.4 差异脂质分析.263.2.5 代谢通路分析.303.3 全氟辛酸对斑马鱼脂质的亚急性毒性.323.3.1 无监督的主成分分析(PCA).323.3.2 有监督的正交偏最小二乘方-判别分析(OPLS-DA).333.3.3 火山图分析.343.3.4 差异脂质分析.413.3.5 代谢通路分析.453.4 本章小结.46第4章基于DESLMSI技术研究全氟辛酸对斑马鱼脂质的干扰.484.1 引言.484.2 全氟辛酸在斑马鱼体内的富集模式.484.3 全氟辛酸暴露对斑马鱼脂质代谢的的干扰.504.3.1 全氟辛
18、酸暴露对脑部脂质代谢的干扰.514.3.2 全氟辛酸暴露对肠道脂质代谢的干扰.534.4 本章小结.53结论.54参考文献.55哈尔滨工业大学学位论文原创性声明和使用权限.70致谢.71-V-万方数据哈尔滨工业大学理学硕士学位论文第1章绪论1.1 全氟辛酸污染现状和毒性效应1.1.1 全氟辛酸在环境中的污染现状(1)全氟辛酸简介全氟和多氟烷基化合物(Per-and polyfluoroalkyl substances,PF ASs)是一类 人工合成的有机化合物,其中碳链连接的氢原子全部被氟原子取代。C-F键的稳 定性使PF ASs具有优良的生物化学和热稳定性,PF ASs头基的亲水性使其具有较
19、 高的表面活性。因此,被广泛用于制造生活和工业用品,比如防晒霜、快餐包装 纸、衣服、半导体、不粘锅以及灭火剂川。PF ASs的大量使用和不合理的处理导 致环境中含量很高。主要存在于环境中PF ASs的有全氟竣酸类、全氟磺酸类、全氟酰胺类等,其 中最稳定的,环境浓度最高的是含有八个碳原子的全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid,PF OA)o PF OA 结构简式为 CF 3(CF 2)6COOH,分子量为 414 g/moL 熔点为 40-50,常温下为白色结晶、微溶于水、疏水疏油。PF OA结构如图1-1所示,整个分子由疏水性全氟化碳链和亲水性竣酸端基构成,具有很强的化学稳定
20、性及 生物稳定性,光和热也很难将其降解。此外,与其它表面活性剂相比,PF OA有图1-1 PF OA结构式(2)全氟辛酸污染现状PF OA已被证明在环境中无处不在,在空气、土壤、水和各种生物基质中均 检测到。空气是陆生生物最直接接触的环境介质,是暴露PF OA的重要途径之一。PF OA能够吸附在空气中悬浮颗粒物上,然后随着悬浮颗粒物被生物吸入体内,对生物体健康造成潜在危险。对国内深圳市空气中PF OA浓度进行检测发现其含 量高到79.0pg/m33。国外空气PF OA浓度审查报告显示加拿大温哥华家庭室内灰 尘及空气中PF OA浓度分别为24ng/m3和47pg/m34,日本部分地区大气中PF
21、OA 万方数据哈尔滨工业大学理学硕士学位论文含量高达919pg/m315。在土壤、沉积物等固相环境中也检测到PF OA。我国东部农村地区土壤PF OA 浓度约为1-15 ng/g,东北大辽河淤泥中PF OA的浓度约0.17 ng/g,深圳河沉积 物中PF OA浓度范围为0.16-0.25 ng/即,PF OA浓度呈现出由南向北逐渐降低的趋 势。在国外,挪威历史上进行过消防培训活动的地点的土壤中PF OA的浓度达 0.23-12.2 Ng/kgM,美国南达科他州进行过消防员培训活动的土壤中PF OA浓度高 达 10-10500 pig/kg90此外,PF OA极其容易在水环境中存在并转移,这对水
22、体生态系统和水生生 物存在潜在的健康威胁。目前,在各个国家的环境水体及作为饮用水源的地下水 中均检测到PF OA,在某些区域PF OA浓度甚至超过1000 ng/L。我国水体污染审 查报告显示,黄浦江流域PF OA浓度高达1594ng/L,约是东江流域的6376倍口叫 在美国开普菲尔河流域80个采样地点中,82.3%的样本中PF OA浓度大于1 ng/L,中位数为12.6 ng/L,最高达287 ng/LW。在马来西亚兰加特河流域人口最多处,PF OA浓度高达到43.5 ng/mL12o 2001-2022年全球地表水PF OA污染情况如图1-2所示。从图中可以看出在各大洲的地表水中均发现PF
23、 OA的存在,中国、澳大 利亚和欧洲地表水PF OA含量远远高于北美和南美洲。此外,研究发现2000年逐 步淘汰长链PF ASs产品并没有对水体PF OA浓度产生重大影响。与淡水流域相比,海洋水域中PF OA的浓度相对较低,北大西洋海域PF OA的浓度范围在52-338 pg/L13o图1-2近20年全球地表水系统中PF OA污染情况口4正是由于PF OA结构的稳定性和分布的广泛性,使其不可避免地在生物体内 持久存在,表现出明显的生物富集性。并且通过食物链的传递和生物放大作用,在生物种群间进行转移,最终高浓度地蓄积在食物链高级生物体内口叫尽管人类 可能通过不同的途径接触PF OA,但饮食摄入似
24、乎是人类接触PF OA的主要途径。根据2012年关于人类膳食食品中PF ASs浓度及其健康风险的审查结果显示,多个国家和地区的食品中检测到PF OAo不同食品中PF OA浓度存在显著差异,-2-万方数据哈尔滨工业大学理学硕士学位论文鱼类和其他海产品是PF OA浓度检测较高的食物。日本明海滩涂区贻贝中 PF OA浓度达9.5 ng/g,7L在中国渤海地区,贝类产品中PF OA浓度高达126 gg/g,8o目前在人类血清中也检测到了 PF OA,普通人群中PF OA的血清浓度约 为3-5 ng/mL,居住在PF OA制造工厂附近的人的血清PF OA浓度高达10000 ng/mL口叫这表明PF OA
25、对生态环境和人体存在严重的健康风险。1.1.2全氟辛酸毒性效应PF OA独特的物理化学性质使其在生物体内与蛋白质牢固地结合,由于生物 体内缺乏对这种化合物的代谢,肝胆循环及肠肝循环。因此,PF OA能够抵抗微 生物降解和脊椎动物代谢,在生物体内长久存在,难以被排出2。,2%对生物体造 成潜在的健康风险。科研人员不断开展相关实验,旨在深入透彻地分析PF OA毒性机制。1990年 到1990年代中期,对PF OA的研究主要集中在各种器官酶上;1990年代中期至 2010年研究的焦点是PF OA引发的肝毒性及其机制研究;自2010年以来,PF OA 引起的神经毒性、肾脏毒性、生殖和发育毒性、内分泌紊
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