CRISPR_Cas系统的挖掘、改造与功能拓展_柳柯.pdf
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1、2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023,4(1):47-66CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展柳柯,林桂虹,刘坤,周伟,王风清,魏东芝(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,鲁华生物技术研究所,上海 200237)摘要:规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)是一种微生物获得性免疫系统,自从证实其可用于基因编辑之后,迅速增强了我们编辑、操纵、注释、检测甚至成像生物体DNA和RNA的能力,为基础生命科学、医学和生物工程等领域的创新发展注入了强劲动力,快速推动了合成生物学等学科的兴盛发展。然而,CRI
2、SPR/Cas系统也有一些固有的问题,例如脱靶效应、原间隔序列邻近基序(PAM)对靶目标的约束性以及基因编辑活性的可控性等,严重制约了该系统在基因精准可控编辑等方面的长足发展,阻碍了其新功能和新应用的拓展。为了突破这些限制,“蛋白质工程修饰Cas蛋白”与“基于生物信息学的新型CRISPR/Cas系统的挖掘”就成为完善发展CRISPR/Cas系统以及扩充CRISPR工具箱的两种重要策略。本文主要针对当前应用最为广泛的类CRISPR/Cas系统,重点介绍了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a这三种代表性系统的基本结构和作用机制,及其在结构改造和功能拓展等方
3、面的新进展,同时也对一些新近发掘的具有重要特色和潜在应用价值的CRISPR/Cas系统进行了综述,例如CRISPR/Cas 和 CRISPR/Cas12k。这些改造和发掘工作显著改善了CRISPR/Cas系统的固有问题,有力地拓展了其功能和适用性,势必会进一步快速推动CRISPR/Cas系统在诸多领域的创新发展。关键词:CRISPR/Cas;基因编辑;脱靶效应;PAM约束;Cas工程改造中图分类号:Q816 文献标志码:A Mining,engineering and functional expansion of CRISPR/Cas systemsLIU Ke,LIN Guihong,LI
4、U Kun,ZHOU Wei,WANG Fengqing,WEI Dongzhi(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,Newworld Institute of Biotechnology,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)Abstract:The clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)and CRISPR-associated protei
5、ns(Cas)were derived from an acquired immune system in microbes.Since their functions on gene editing have been reported,they have been rapidly used to enhance our ability to edit,regulate,annotate,detect,and image DNA and RNA fragments of various organisms,which consequently have faciliated fundamen
6、tal research in life science,收稿日期:2021-02-08 修回日期:2021-04-28基金项目:国家自然科学基金(21978084)引用本文:柳柯,林桂虹,刘坤,周伟,王风清,魏东芝.CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展 J.合成生物学,2023,4(1):47-66Citation:LIU Ke,LIN Guihong,LIU Kun,ZHOU Wei,WANG Fengqing,WEI Dongzhi.Mining,engineering and functional expansion of CRISPR/Cas systemsJ.Synthe
7、tic Biology Journal,2023,4(1):47-66DOI:10.12211/2096-8280.2021-022特约评述合成生物学 第 4 卷medicine,bioengineering and so on,and drived the development of synthetic biology and other disciplines.However,CRISPR/Cas systems also have some inherent drawbacks,such as off-target effect,constraint of protospacer-ad
8、jacent motif(PAM)on the target,and controllability of the gene editing activity,which substantially compromise their applications in highly precise and controllable gene editing.In order to overcome these challenges,two important strategies have been employed to develop enhanced CRISPR/Cas systems a
9、nd expand the CRISPR toolbox,including modifying the Cas proteins by protein engineering and mining novel CRISPR/Cas systems with bioinformatics.In the review,focusing on the most widely used the type II CRISPR/Cas systems,we mainly introduce the basic structures and functions of three representativ
10、e systems,including CRISPR/Cas9,CRISPR/Cas12a and CRISPR/Cas13a,as well as recent progress in their structural modifications and functional expansion.Thereinto,engineering strategies for CRISPR/Cas systems have been systematically commented,which include modification methods for Cas proteins and the
11、 way to expand the function of CRISPR/Cas systems by coupling specfic proteins with Cas.In addition,we also review some novel CRISPR/Cas systems with important characteristics and potential applications that have been discovered in recently years,such as CRISPR/Cas and CRISPR/Cas12k.These engineerin
12、g modifications and mining work have greatly addressed the inherent problems of the CRISPR/Cas systems,and effectively expanded their functions and applicability,which will further promote the applications of the CRISPR/Cas systems in many fields.Keywords:CRISPR/Cas;gene editing;off-target effect;PA
13、M constraints;Cas engineeringCRISPR/Cas是一种协助细菌和古生菌抵御外来遗传元件入侵的适应性免疫系统,包含两个主要部分:由重复序列和间隔序列规律成簇排列形成的CRISPR阵列和一系列CRISPR相关蛋白1-3。在生理上,这种微生物免疫系统发挥功能一般包括3个阶段:第一阶段,又称适应阶段,由Cas蛋白复合物(通常为CRISPR适应模块所编码的Cas蛋白)锚定入侵遗传物质,随后切离一部分称为前间隔序列(protospacer)的特定 DNA 序列,并将其插入到两个重复序列之间,作为特定的间隔序列;第二阶段,或称表达及加工阶段,由CRISPR阵列转录为前体 CRI
14、SPR RNA(简称 pre-crRNA),随后由不同的Cas蛋白复合物(有时需要额外蛋白以及RNA分子的协助)加工成为成熟048第 4 卷 的 CRISPR RNAs(简称为 crRNAs);第三阶段,或称为干扰阶段,加工成熟的crRNAs与Cas蛋白复 合 物 结 合 并 特 异 性 靶 向 切 割 目 标 DNA 或RNA4-7。正 是 基 于 这 种 独 特 的 功 能 机 制,CRISPR/Cas系统迅速发展成为了新一代基因编辑工具,由于其易于设计、成本低廉、编辑效率高等优势,该工具一经出现就快速取代了锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)8、转录激活样因子
15、效应物核酸酶(transcription activator-like effectors nuclease,TALEN)等传统基因编辑工具9,形成了功能更为强大的基因编辑技术,并广泛应用于基因调控10-12、表观修饰13-15、碱基编辑16-17、基因成像18-20等不同领域,且在微生物、植物、动物甚至人体内表现出了广泛的适用性21-25,强有力地推动了基础生命科学、医学和生物工程等学科的快速发展,尤其是为合成生物学的突破式发展提供了重要技术支撑。鉴于CRISPR/Cas系统对科学与社会重要而深远的影响,其奠基人 Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier因
16、此斩获了2020年度的诺贝尔化学奖26。CRISPR/Cas系统的成功应用,激发了人们对其更多的期待,因此CRISPR/Cas系统被不断地应用于疾病特异性检测、基因治疗和细胞功能精准调控等新领域。尽管相关工作已经取得了令世人瞩目的成就,然而CRISPR/Cas系统固有的脱靶效应、PAM对可编辑基因的限定性和基因编辑活性的可控性等问题,严重影响了CRISPR/Cas系统在应用过程中的精准性、灵活性、可控性和安全性,阻碍了其功能和应用范围的进一步拓展27-31。为了解决这些难题,优化改造现有CRISPR/Cas系统和发掘具有新颖功能特色的CRISPR/Cas新系统,就成为近些年来获得性能更优、用途
17、更广的基因编辑系统的重要策略。目前针对CRISPR/Cas系统常见的优化改造工作有:对向导RNA(guide RNA,gRNA)的优化设计32-33,对Cas蛋白与向导RNA浓 度 的 优 化34-36,对 Cas 蛋 白 的 工 程 化 改造30-31,35,37-45等;而对于 CRISPR/Cas 新系统发掘,近几年也有许多重要的进展,发现了多种极具特色的新式CRISPR/Cas系统,包括Cas12a/b/c、Cas13a/b/c、Cas、Cas12k等46-54。无论采用何种方式,获得功能更加出色、应用范围更广的CRISPR/Cas工程系统始终是科研工作者所追求的目标。本文着眼于近些年
18、来CRISPR/Cas系统的相关发展,重点介绍了具有广泛应用价值的类CRISPR/Cas系统的优化改造方法和相关进展,并对新近发掘的具有重要特色和应用价值的CRISPR/Cas 系 统 进 行 了 综 述。这 些 工 作 显 著 提 升 了CRISPR/Cas系统的功能,拓展了其应用价值,有利于CRISPR/Cas系统在新领域的创新发展,也为进 一 步 改 进 拓 展 CRISPR/Cas 系 统 指 明 了 发 展方向。1 CRISPR/Cas的分类在长期进化过程中,CRISPR/Cas产生了多种多样的组织形式和相应的Cas蛋白,对其进行清晰的分类十分困难46-47,55。目前,CRISPR
19、/Cas系统已有2个大类(类和类)、5个小类和16个亚类,最近又新增了第6小类和3个新亚类46,55。在已鉴定的CRISPR/Cas系统中,以类CRISPR/Cas为主,占比多达90%左右,广泛分布于细菌和古生菌中,由于其效应复合物十分复杂,通常需要47个Cas蛋白亚基,因此应用于基因编辑时实用性往往不佳,使得编辑过程变得复杂烦琐55。而相较于类系统,类CRISPR/Cas可以通过单个多功能域的 Cas 蛋白发挥 DNA 或 RNA 的切割功能,因此类CRISPR/Cas系统易于设计改造,再加上其能以双链断裂(double-strand breaks,DSBs)的方式高效切割靶核酸序列,故而类
20、 CRISPR/Cas最早被开发并应用于基因编辑等工作55-58。在类CRISPR/Cas中,CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a最具代表性,应用最为成功和广泛,下面我们重点对这三种系统进行详细介绍。1.1 CRISPR/Cas9系统Cas9是最早被发现和表征的类CRISPR/Cas效应蛋白,是目前应用最为广泛的 Cas 蛋白之一21,59-61。Cas9蛋白为二裂片结构,分为核酸酶叶(nuclease lobe,NUC)和识别叶(recognition lobe,REC)两部分,两部分形成的中央通道可容纳靶 DNA 和 crRNA 配对形成的异源双链
21、核酸分049合成生物学 第 4 卷子,REC与 gRNA的识别结合密切相关,而NUC则主要负责DNA链的切割61。NUC可进一步划分为 HNH 域、RuvC 域、楔形域(wedge domain,WED)和 PAM 互作域(PAM-interacting domains,PI),前两者分别用于切割靶DNA链和其互补链,产生平末端结构,PI则与PAM序列的识别与结合有关。REC可继续划分为REC1、2、3域以及富含精 氨 酸 的 桥 螺 旋 结 构(bridge helix,BH)61-63 图1(a)。虽然许多Cas9蛋白的三维结构已经得到了解析,但对于多个域的具体功能并未得到完全阐明,因而通
22、过完全理性的方式来优化改造Cas9仍较为困难61-64。在功能上,Cas9是一种由crRNA和反式激活crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)引导的 DNA 核酸内切酶,其发挥作用起始于 CRISPR阵 列 转 录 为 pre-crRNA,随 后 tracrRNA 与 pre-crRNA的重复序列互补,并与Cas9蛋白结合在一起形成RNA-蛋白复合体61,63。接着,核糖核酸内切酶 RNase 对 RNA-蛋白复合体上的 pre-crRNA进行加工剪切,使其为成熟的 crRNA。然后活性Cas9-RNA 复合体扫描基因组 3端富含鸟嘌呤的PAM序列,并识别出
23、与成熟crRNA互补的靶DNA序列,之后在成熟的crRNA与靶DNA互补碱基配对的驱动下形成R环,Cas9 蛋白的 RuvC 和 HNH活性域分别对靶向DNA链和非靶向DNA链进行切割,从而引发 DNA 双链断裂61,63图1(d)。基于这种机制,人们设计开发了基于 CRISPR/Cas9的基因编辑工具,通过对靶基因的切割,就可以利用非同源末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ)或 同 源 重 组(homologous recombination,HR)等 DNA 修补机制,对目标靶点进行基因敲除、整合、倒位、易位、单碱基突变以及基因表达抑制、激活、标记等编辑
24、操作21,59-60,65-68。这种基因编辑方法精准高效、易于设计、操作简单且在不同物种中均有良好表现,得到了快速的应用推广,解决了先前许多物种基因组难于编辑的难题,成为近些年来生物技术发展一项重大成就。但是Cas9也有一些不足之处:一是其识别的PAM 序列为 5-NGG,该序列在许多低 GC含量的基因组中出现的频率较低,例如在人类基因组中平均每8个碱基才有可能出现1个PAM序列,这严重制约了其对基因组大部分位点的编辑69;二是脱靶效应,gRNA同靶结合区的结合可以容纳多达7个碱基的错配27,因而CRISPR/Cas9系统在基因组编辑过程中不可避免地会发生难以预测的脱靶现象。Fu等对 CRI
25、SPR/Cas9系统的脱靶效应进行了评估,结果表明其脱靶率高达 66%,这对于许多需要对基因组进行精准编辑的工作来说是一个严重的问题,例如在医学上用于基因治疗27。因此如何增强 CRISPR/Cas9 系统用于基因编辑的灵活 性 和 特 异 性 是 亟 待 解 决 的 关 键 科 学 问题28,33,69。除此之外,CRISPR/Cas9系统的有效传递方式、对部分序列编辑活性不足、Cas9蛋白毒性等问题也对其应用有一定的限制70-72。总的来说,对基于 CRISPR/Cas9 系统的基因编辑工具的开发和应用,极大增强了科研工作者对于不同物种基因编辑的能力,但其相应的不足之处也十分明显。因此如何
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