DBS13∕ 003-2015 食品安全地方标准 阪崎肠杆菌和沙门氏菌检测.pdf
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1、2015-04-23 发布2015-05-01 实施DBS13河北省地方标准DBS13/0032015食品安全地方标准阪崎肠杆菌和沙门氏菌检测河北省卫生和计划生育委员会河北省卫生和计划生育委员会发布发布DBS13/0032015I前言本标准按GB/T 1.1-2009规定的格式编写。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2015年4月23日首次发布。DBS13/00320151食品安全地方标准阪崎肠杆菌和沙门氏菌检测1范围本标准适用于应用实时荧光定量PCR法定性检测阪崎肠杆菌和沙门氏菌。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于
2、本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 4789.4食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验。GB 4789.40食品安全国家标准 食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验。3方法提要阪崎肠杆菌和沙门氏菌均属于肠杆菌科,本检测方法首先对肠杆菌科和阪崎肠杆菌进行同步检测。当肠杆菌科为阴性时可直接报告沙门氏菌阴性;当肠杆菌科为阳性时再进行沙门氏菌的检测;当阪崎肠杆菌为阳性时需按照GB 4789.40进行确证;当沙门氏菌为阳性时需按照GB 4789.4进行确证。4设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:4.1 二级生物安全柜4.2磁力搅
3、拌器:0-2400 r/min。4.3卤素灯:500 W。4.4低温离心管架:1.5 mL,0。4.5水浴锅或金属恒温加热器:5-100。4.6漩涡振荡器。4.7离心机:12000 r/min。4.8移液器及对应吸头:10 L、100 L、200 L、1000 L。4.9超净工作台。4.10实时荧光定量 PCR 仪(含有 FAM-,HEX-和 ROX-检测通道)。4.11冰箱:2 8 和-20 两种。DBS13/003201524.12天平:感量 0.1 g。4.130.2 mL 8 联排管以及 8 联排帽(与 PCR 仪配套使用)。4.141.5 mL 无菌透明离心管。4.15恒温培养箱:2
4、5 1,36 1,44 0.5。4.16无菌锥形瓶:容量 100 mL、200 mL、2000 mL。5培养基和试剂除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯。5.1缓冲蛋白胨水(BPW):见附录 A.1。5.2营养肉汤培养基(NB):见附录 A.2。5.3125 g/mL 溴化乙锭单叠氮溴溶液(EMA):见附录 A.3。5.4DNA 提取缓冲液:0.1%Chelex100(螯合树脂)水溶液。5.5吐温 80。5.6按照表 1 和表 4 的序列合成的引物和标记的探针。5.7Taq DNA 聚合酶:5 U/L。5.8Taq PCR 缓冲液。5.950 mmol/L MgCl2溶液:见附录 A.4。
5、5.10dNTPs(dATP,dUTP,dCTP,dGTP),浓度均为 10 mmol/L。5.11尿嘧啶-N-糖基化酶:1 U/L。5.12pUC19 质粒 DNA,200 拷贝/L。5.13阪崎肠杆菌质控菌株:ATCC 29544,或等效菌株。5.14沙门氏菌质控菌株:ATCC 13311,或等效菌株。5.15大肠杆菌质控菌株:ATCC 10536,或等效菌株。5.16金黄色葡萄球菌:CICC 10301,或其它非肠杆菌科的阴性质控等效菌株。6检验程序检验程序见图1。DBS13/0032015336 1,16 h-20 h图 1 检验程序7操作步骤7.1首次增菌称取样品 100 g(mL)
6、加入到 900 mL 预热至 37 的 BPW 中,充分混匀,36 1 培养 16 h 20 h。对于含有超过20%脂肪含量的样品,需要在BPW中加入1 g/L(每10%脂肪含量)的吐温80。7.2二次增菌充分摇匀首次增菌液,吸取50 L转种于450 L预热至37 的BPW中,36 1 培养3 h4 h。7.3样品模板 DNA 的制备7.3.1吸取 100 L 二次增菌液加入到 1.5 mL 无菌透明离心管中;加入 400 L EMA 溶液,室温下暗室培养 5 min。7.3.2将离心管放入低温离心管架中,置于 500W 卤素灯正下方,相距 15 cm-20 cm,曝光 5 min 后,100
7、00 r/min 离心 5 min。7.3.3用移液器移除上清液,加入 200 L DNA 提取缓冲液,充分混匀后,置于 95-100 水浴锅或金属恒温加热器中维持 10 min。7.3.4室温下静置 1 min,振荡混匀,12000 r/min 离心 2 min,上清液即为 DNA 模板。7.4质控菌株模板 DNA 的制备检样 100 g(mL)加入到 900 mL BPW 中进行首次增菌50 L 首次增菌样品加入到 450 L BPW 中进行二次增菌36 1,3 h-4 h100 L 二次增菌样品加入到 EMA 溶液中(灭活死亡细胞的 DNA)DNA 的提取实时荧光定量 PCR 检测阴性结
8、果报告阳性GB 4789.40、GB 4789.4 进行确证DBS13/00320154分别接种供试的阳性对照菌株(大肠杆菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌)和阴性对照菌株(金黄色葡萄球菌)到10 mL NB培养液中,36 1 培养过夜,各取1.5 mL增菌液,同上离心、提取DNA模板。7.5PCR 反应所用引物和探针工作液的配制根据表1反应体系中每种引物和探针的终浓度,使用灭菌去离子水配制含有6种目标基因引物的工作液(浓度分别为10 mol/L)和含有3种探针的工作液(浓度分别为10 mol/L)。表 1目标基因引物和探针序列及每个反应体系内的终浓度引物和探针名称序列终浓度(mol/L)肠杆菌科-F5
9、-CTG AAA GCA TCT AAG CAC GAA ACT TG-30.4肠杆菌科-R5-GTC GTC TTC AAC GTT CCT TCA GG-30.4阪崎肠杆菌-F5-AGG GGA TAT TGT CCC CTG AAA CAG-30.4阪崎肠杆菌-R5-AAA CGA GAA TAA GCC GCG CAT T-30.4内部扩增对照(IAC)-F5-TGT GAA ATA CCG CAC AGA TG-30.4内部扩增对照(IAC)-R5-AGC TGG CGT AAT AGC GAA G-30.4肠杆菌科探针5-FAM-CCCGAGATGAGTTCTCCCTGASMCTT
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