DB15∕T 2835-2022 马驽巴贝斯虫检测 PCR法(内蒙古自治区).pdf
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1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 28352022 马驽巴贝斯虫检测 PCR 法 PCR method for detection of babesiosis caballi 2022-12-08 发布 2023-01-08 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 28352022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国二连海关、内蒙古自治区市场监督管理评审查验中心。本文件主要起
2、草人:陈少博、杨帆、王伊琴、常鸿、包勇敢、荆文魁、腾克、赵治国。DB15/T 28352022 1 马驽巴贝斯虫检测 PCR 法 1 范围 本文件规定了马驽巴贝斯虫PCR法和实时荧光PCR检测方法。本文件适用于马属动物马驽巴贝斯虫病的分子生物学诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用
3、于本文件。马驽巴贝斯虫 babesiosis caballi 马驽巴贝斯虫是引起马驽巴贝斯虫病的病原体,是一种寄生于马、驴、骡、斑马等马属动物红细胞内的血液原虫。聚合酶链式反应 polymerase chain reaction;PCR 用于扩增位于已知序列之间DNA(deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)的方法。模板DNA经过高温变性成单链,在DNA聚合酶和适宜的温度下,两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分别于模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火,接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP(deoxyribo nucleoside triphosphate,脱氧核苷酸三磷
4、酸)为底物,使退火引物得以延伸,如此反复变性、退火和DNA合成这一循环,使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增,经2530个扩增循环,扩增倍数达到106。实时荧光 PCR real-time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。Ct 值 cycle threshold DB15/T 28352022 2 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(base pair)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trithyl ammonium bromide)DNA:脱氧核糖
5、核酸(deoxyribonucleic acid)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)TAMRA:羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane 5 试剂与材料 水:符合 GB/T 6682 的要求。DNA 提取试剂盒。CTAB。Tris-HCl(pH 8.0)。NaCl。ED
6、TA。蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL)。三氯甲烷。异丙醇。75%乙醇。Taq 酶。dNTP(2.5 mmol/L)。PCR buffer。DNA 分子量标准(DNA Marker)(50 bp500 bp)。实时荧光 PCR 预混液。阳性对照样品:采用已知含有马驽巴贝斯虫的 DNA,或经测序确认的阳性质粒。见附录 B。阴性对照样品:采用已知不含有马驽巴贝斯虫的 DNA。空白对照:ddH2O。引物及探针:见表 1。DB15/T 28352022 3 表1 马驽巴贝斯虫检测引物及探针 6 仪器与设备 PCR 仪。凝胶成像仪。实时荧光 PCR 仪。高速台式离心机(最高转速 12000 rpm)。
7、旋涡振荡器(最高转速 3000 rpm)。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温水浴锅。天平(感量 0.01 g)。单孔道微量移液器:0.5 L10 L、10 L100 L、20 L200 L、100 L1000 L。7 样品采集 使用添加EDTA抗凝剂的采样管无菌采集血样。8 检测方法 PCR 法 8.1.1 样品的总 DNA 提取 参照附录A中提取样品DNA的方法提取DNA,也可采用等效商品化的血液DNA提取试剂盒进行。当DNA浓度吸光度值A260/A280在1.71.9之间时,适宜于PCR扩增。设置至少两个平行样品且需设立阴性、阳性及空白提取对照。8.1.2 PCR 扩增 反应体系为50
8、L,体系组成见表2。检测方法 引物/探针 序列(5-3)扩增片段 PCR法 上游引物(F)5-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3 200bp 下游引物(R)5-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3 实时荧光PCR法 上游引物(F)5-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3 200bp 下游引物(R)5-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3 探针(P)5-(FAM)-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTG-(TAMRA)-3 DB15/T 28352022 4 表2 PCR 扩增反应体系组成 试剂名称 贮备液浓度 反应体系体积L 10Buffer(含 Mg2+)
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