黄连标准汤剂、配方颗粒与盐酸小檗碱对大肠埃希菌的抑菌作用机制研究.pdf
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1、.930.文章编号:1001-8689(2023)08-0930-07收稿日期:2022-06-07项目基金:四川省科技成果转化示范项目(No.23ZHSF0218);成都大学20212023年研究生人才培养质量和教学改革立项项目(No.cdjgy2022004);四川省20212023年高等教育人才培养质量和教学改革项目(No.JG2021-1106);四川省2022年农业科技成果转化项目(No.2022NZZJ0015)作者简介:马聪,男,生于1999,在读硕士研究生,研究方向为中成药新药研发及质量再评价研究,E-mail:1245017015 *通信作者,E-mail:黄连标准汤剂、配方
2、颗粒与盐酸小檗碱对大肠埃希菌的抑菌作用机制研究马聪1 余志晴2 田佩灵2 杨俊莉2 雷燕莉2 唐焓嫣2 徐玉玲3,4,*(1 成都大学食品与生物工程学院,成都 610106;2 成都大学药学院,成都 610106;3 成都大学四川抗菌素工业研究所,成都 610106;4 四川省抗病毒中药产业化工程技术研究中心,成都 610106)摘要:目的 探究黄连标准汤剂、配方颗粒与盐酸小檗碱对大肠埃希菌的抑菌作用机制,为黄连配方颗粒抑菌机制的研究提供参考。方法 利用二倍稀释法测定黄连标准汤剂、配方颗粒及盐酸小檗碱对大肠埃希菌(EC)的最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC),并根据测定的结果进行EC
3、抑菌曲线的绘制、胞外可溶性蛋白相对含量、电导率的研究。结果 黄连标准汤剂、配方颗粒与盐酸小檗碱对EC的MIC分别为3.14、5.06和0.80 mg/mL;MBC的结果分别为3.14、10.13和3.19mg/mL;EC在黄连标准汤剂、配方颗粒与盐酸小檗碱质量浓度为1MIC和1/2MIC的情况下生长受到明显抑制,空白组EC生长良好;在供试品质量浓度为1MIC和2MIC情况下,随着时间增加,EC胞外可溶性蛋白相对含量、电导率都有不同程度的上升。结论 在黄连标准汤剂、配方颗粒与盐酸小檗碱的作用下,EC细胞膜通透性增加,使细胞内容物泄露,从而达到抑菌作用。关键词:大肠埃希菌;黄连标准汤剂;配方颗粒;
4、盐酸小檗碱;抑菌作用机制中图分类号:R978.1 文献标志码:AStudy on the antibacterial mechanism of Huanglian standard decoction,formula granules,and berberine hydrochloride on Escherichia coliMa Cong1,Yu Zhiqing2,Tian Peiling2,Yang Junli2,Lei Yanli2,Tang Hanyan2,and Xu Yuling3,4(1 College of Food and Bioengineering,Chengdu Un
5、iversity,Chengdu 610106;2 Chengdu University Pharmaceutical College,Chengdu 610106;3 Sichuan Institute of Antibiotic Industry,Chengdu University,Chengdu,610106;4 Sichuan Provincial Engineering Research Center for Antiviral Chinese Medicine Industrialization,Chengdu 610106)Abstract Objective To explo
6、re the antibacterial mechanism of Huanglian standard decoction,formula granules,and berberine hydrochloride on Escherichia coli,and to provide a reference for the study of antibacterial mechanism of Huanglian formula granules.Methods The minimum inhibitory concentration(MIC)and the minimum bacterici
7、dal concentration(MBC)of Coptis standard decoction,formula granules,and berberine hydrochloride on Escherichia coli(EC)were determined by the principle of the double dilution method.According to the results of the determination,the antibacterial curve of EC,the relative content of extracellular solu
8、ble proteins,and 药理与临床中国抗生素杂志2023年8月第48卷第8期.931.黄连标准汤剂、配方颗粒与盐酸小檗碱对大肠埃希菌的抑菌作用机制研究 马聪等黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎,具有清热燥湿、清热解毒的功效,传统中医用其治疗湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、痈疽疮毒、心火亢盛等1;现代药理学研究表明,黄连具有抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤、止泻、抑制血小板凝集、抑制胃液分泌等作用2,并且由于其显著的抑菌活性,素有“中
9、药抗生素”的美称3。其中主要成分小檗碱在抑菌活性中起着重要作用,作为广谱抗菌药,具有很强的抗菌功效,对革兰阳性和革兰阴性菌(如大肠埃希菌)的附着均具有抑制作用4,临床上多用于消化道疾病的治疗。大肠埃希菌是条件致病菌,在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。中国药典2020版一部黄连项下将表小檗碱、黄连碱、巴马汀及小檗碱作为黄连的指标性成分,其中小檗碱根据已有研究可确定为黄连的质量标志物(Q-maker)之一5-8。中药Q-marker与中药功能属性密切相关,是可以定性定量的特有化学成分,作为反映中药安全性和有效性的标示性物质进行质量控制9。中药配方颗粒是中药
10、材或饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成,用来对其进行质量控制的主要参照物就是标准汤剂。标准汤剂来源于中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求,其可作为中药饮片和中药配方颗粒间的“桥梁”,从而探索配方颗粒是否能够承载饮片的安全性和有效性。为了研究黄连配方颗粒、标准汤剂以及黄连质量标志物小檗碱三者之间的抑菌作用及机制异同,本文以大肠埃希菌为代表,对黄连配方颗粒、标准汤剂及盐酸小檗碱对大肠埃希菌抑菌作用及其机制进行了研究。1 实验材料与仪器1.1 实验材料与试剂购自重庆、四川等道地产区的黄连,经成都大学食品与生物工程学院刘涛教授鉴定为毛茛科植物Coptis chinensis Franch.黄连的
11、干燥根茎;大肠埃希菌菌株(成都大学附属医院提供);盐酸小檗碱对照品(四川省维克奇生物科技有限公司;批号wkq19042611;HPLC97.8%);考马斯亮蓝G250(成都市科隆化学品有限公司;批号2020050601);其他实验材料包括蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、酵母浸出粉等。1.2 实验仪器TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);DDS-307A电导率仪(上海仪店科学仪器股份有限公司);DH3006A型电热恒温培养箱(西安禾普生物科技有限公司);JJ-CJ-2FD洁净工作台(苏州市金净净化设备科技有限公司);ZQTY-70E振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司);XFS
12、-280手提式压力蒸汽灭菌器(浙江新丰医疗器械有限公司);TG20G离心机(天津广丰科技科技有限公司);FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验有限公司);旋转蒸发仪(成都康宇科技有限公司);恒温水浴锅(成都康宇科技有限公司)。2 方法2.1 样品的制备2.1.1 黄连标准汤剂的制备the conductivity were studied.Results The MICs of Huanglian standard decoction,formula granules,and berberine hydrochloride against E.coli were 3.14,5.06 and
13、 0.80 mg/mL,respectively.MBC results were 3.14,10.13 and 3.19 mg/mL,respectively;the growth of EC was significantly inhibited when the mass concentrations of Huanglian standard decoction,formula granules,and berberine hydrochloride were 1MIC and 1/2MIC,and the blank group grew well.Under the conditi
14、ons of 1MIC and 2MIC,the relative content and conductivity of EC extracellular soluble proteins increased to varying degrees with the increase of time.Conclusion Under the action of Huanglian standard decoction,formula granules,and berberine hydrochloride,the permeability of EC cell membrane increas
15、es,and the cell content leaked,so as to achieve antibacterial effects.Key words Escherichia coli;Huanglian standard decoction;Formula granules;Berberine hydrochloride;Antibacterial mechanism.932.根据中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求,称取适量黄连原药材,加9倍药材质量的水浸泡30 min,加热,煮沸30 min,滤过;药渣再加入7倍量水,加热,煮沸30 min,滤过;合并滤液,于旋转蒸发仪上65
16、减压浓缩至相对密度为1.21.5(65),将浓缩的浸膏冷冻干燥成粉末。2.1.2 黄连配方颗粒的制备按照中药配方颗粒国家药品标准(第一批),称取适量黄连原药材,加入9倍药材质量的水,浸泡30 min,煎煮3次,每次90 min;合并每次的滤液于旋转蒸发仪上减压浓缩得浸膏(相对密度1.21.5,80),冷冻干燥得黄连配方颗粒中间体;按照中间体:辅料玉米淀粉=1:0.8的比例加入黄连配方颗粒中间体和辅料,混合均匀后滴加适量95%乙醇,制粒,整粒,即得。2.1.3 黄连标准汤剂供试品的制备称取约125 mg黄连标准汤剂,精密称定,置于离心管,精密加入10 mL纯化水溶解,摇匀,于10000 r/mi
17、n离心15 min,取上清液,制成的质量浓度约为12.5 mg/mL,高压蒸汽灭菌,备用。2.1.4 黄连配方颗粒供试品的制备称取约0.2 g黄连配方颗粒,精密称定,置于离心管,精密加入10 mL纯化水溶解,摇匀,于10000 r/min离心15 min,取上清液,制成的质量浓度约为20 mg/mL,高压蒸汽灭菌,备用。2.1.5 盐酸小檗碱供试品的制备称取约6 mg盐酸小檗碱对照品,精密称定,置于2 mL量瓶中,加入适量纯化水使其溶解,用纯化水定容,制成的质量浓度约为3 mg/mL,紫外灯下灭菌,备用。2.2 菌株的活化液体培养基:称取5 g蛋白胨,2.5 g酵母浸出粉,5 g氯化钠,加蒸馏
18、水定容至500 mL;固体培养基:称取5 g蛋白胨,2.5 g酵母浸出粉,5 g氯化钠,7.5 g琼脂粉,加热使琼脂溶解,用蒸馏水定容至500 mL。将菌种接种于液体培养基中,于37,120 r/min振荡培养箱中连续培养24 h,得菌悬液,备用。2.3 体外抑菌活性测定方法建立2.3.1 菌悬液的稀释吸取一定量活化菌悬液,用液体培养基进行稀释,调整浊度至0.75108 CFU/mL 11。2.3.2 最小抑菌浓度的测定(minimum inhibitory concentration,MIC)取无菌96孔一次性细胞培养板,在1、2号孔加入100 L“2.1.3”项下溶液,在27号孔预先加入1
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