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基因沉默SIRT7抑制缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖及迁移.pdf
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1、基金项目:陕西省重点研发计划项目()作者简介:张莹,女,生,硕士,副主任医师,:收稿日期:基因沉默 抑制缺氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖及迁移张莹,高砚丽,任引刚(空军军医大学第二附属医院老年医学科,西安 ;通讯作者,:)摘要:目的研究沉默信息调节因子 相关酶类(,)对低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞(,)增殖和迁移的调控作用,并探讨可能的分子作用机制。方法体外培养 建立低氧模型。通过慢病毒介导的短发卡 (,)干扰技术沉默 在 中的表达。实验分为 组:常氧对照组、低氧组、低氧 组和低氧 组。低氧 组 感染对照重组腺病毒 ,然后进行低氧处理。低氧 组 感染表达 的重组腺病毒 ,然后进行低氧处理。采用实
2、时定量 (,)检测 的 表达水平。采用 检测 、转化生长因子 (,)、转化生长因子 受体(,)、和 的蛋白表达量。采用细胞计数试剂盒 (,)和 乙炔基 脱氧尿苷(,)实验检测细胞增殖。采用流式细胞术检测细胞凋亡。采用 实验检测细胞迁移。结果与常氧对照组比较,低氧组和低氧 组 表达水平显著升高(),细胞增殖和迁移水平显著提高(),细胞凋亡率显著降低();与低氧组和低氧 组比较,低氧 组 表达水平显著降低(),细胞增殖和迁移水平显著下降(),细胞凋亡率显著增加()。与常氧对照组比较,低氧组和低氧 组 、和 的蛋白表达量显著增加();与低氧组和低氧 组比较,低氧 组 、和 的蛋白表达量显著减少()。
3、结论基因沉默 通过调控 信号通路抑制缺氧诱导的 增殖和迁移。关键词:肺动脉高压;肺动脉平滑肌细胞;细胞增殖;细胞迁移;中图分类号:文献标志码:文章编号:():,(,;,:):()()():,()()(),(),(),()(),(),(),(),(),(),(),(),():;肺动脉高压是一类常见的心血管疾病,预后极差,严重危害人类的健康 。肺动脉高压可导致右心室肥大和衰竭,最终引起死亡 。肺动脉高压的病理相当复杂,血管重塑被认为是肺动脉高压的主要病理特征 。平滑肌细胞过度增殖和肥大导致的中膜增厚,是血管重塑重要过程之一。在病理条件的刺激下,肺动脉平滑肌细胞由收缩型转化为合成型,合成型的平滑肌细
4、胞具有更强的增殖和迁移能力,从而导致肺动脉中膜增厚,血管阻力增加,导致血管压力持续升高 。目前临床治疗肺动脉高压的效果并不令人满意,无法阻止和逆转疾病的进展过程 。肺动脉高压涉及多种基因的异常表达和信号通路的调控,发掘对肺动脉平滑肌增殖和迁移具有重要调控的基因,可为该疾病的临床治疗干预提供新的思路和治疗靶标。转化生长因子 (,)是一个多能效的细胞因子,调控多种生物学过程,并参与多种疾病的发生和进展过程 ,。与转化生长因子 受体 (,)结合,引起细胞质内 和 的磷酸化,然后磷酸化的 蛋白复合体入核,从而激活下游基因的表达 。激活后的 信号通路可调控细胞增殖、迁移、细胞外基质合成、细胞分化和细胞表
5、型转化等生物学功能 。据报道,信号通路的过度激活与肺动脉高压的进展密切相关 。信号通路通过促进肺动脉平滑肌细胞的过度增殖和迁移,引起血管重塑,导致肺动脉高压的发生 。靶向抑制 信号通路已成为开发肺动脉高压治疗的新策略。因此,信号通路在肺动脉高压中的调控机制值得进一步的研究,探寻对该信号通路具有重要调控作用的分子,对于开发新的治疗方法具有十分重要的意义。沉默信息调节因子相关酶类(,)是 蛋白家族的重要一员,具有组蛋白去乙酰化酶和去琥珀酰化酶的活性 。参与多种生物学过程,包括细胞衰老、细胞应激、代谢反应和炎症反应等,在多种病理条件下发挥关键作用 ,。据报道,过表达能够促进气道平滑肌细胞的增殖和迁移
6、 ,表明 可能参与平滑肌细胞表型转化。目前,关于 是否参与肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移,还没有相关研究。体外低氧培养人肺动脉平滑肌细胞(,)引起细胞的过度增殖和迁移,是体外模拟肺动脉高压研究的经典模型。本文通过该模型研究 对低氧诱导的 增殖和迁移的调控作用,并探讨其可能的分子作用机制。材料和方法 材料与试剂 购自美国菌种保藏中心 ;提取试剂 、和 试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司;合成试剂 盒 和 购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司;蛋白提取试剂盒和蛋白浓度测定试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司;购自上海吉玛制药技术有限公司;凋亡试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;兔抗人 抗体
7、、抗体、抗体和 标记的山羊抗兔二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司;兔抗人 抗体购自上海艾博抗贸易有限公司;兔抗人 抗体、抗体、抗体和 抗体购自美国 公司。实验方法 细胞培养和慢病毒感染将 接种于含平滑肌细胞生长因子的专属培养基中,置于 的培养箱中 生长。将 接种于 孔板中(个 孔),按感染复数(,)为 加入慢病毒,并添加 提高感染效率。将细胞板放回细胞培养箱孵育,后更换新鲜培养基,继续培养 ;中途更换细胞液,保持良好细胞状态。收集细胞检测靶基因表达变化,并进行后续实验。细胞分组和处理将 分为:常氧山西医科大学学报,年 月,第 卷 第 期对照组、低氧组、低氧 组和低氧 组。常氧对照组 置于常氧培养
8、箱中(含 和 空气)孵育 。低氧组 置于厌氧培养箱中(含 、和 )孵育培养 ,建立低氧诱导模型。低氧 组 感染对重组照腺病毒 ,然后进行低氧处理。低氧 组 感染表达 的重组腺病毒 ,然后进行低氧处理。检测 的 表达待细胞处理完成,收集细胞,加入 充分裂解细胞,按试剂盒步骤抽提细胞总 。采用 合成试剂盒,根据试剂盒操作步骤,将 逆转录为 。将 、和引物混合为 反应体系,采取预变性 ,;个循环的热循环程序(变性 ,;退火 延伸 ,)进行 扩增。以 为内参基因,采用 公式分析 结果,计算基因相对表达水平。检测 、和 的蛋白表达待细胞处理完成,收集细胞,加入蛋白提取缓冲液和蛋白酶抑制剂,充分裂解细胞,
9、提取细胞总蛋白。测定蛋白浓度后,按 孔将蛋白样品加到配置好的浓缩胶孔中,进行 电泳。电泳完成,将蛋白从分离胶中转移到 膜上。将膜放入 脱脂奶粉中,室温封闭 。将膜放入一抗稀释液(抗体稀释度为 ;抗体稀释度为 ;抗体稀释度为 ;抗体稀释度为 ;抗体稀释度为 ;抗体稀释度为 ;抗体稀释度为 ;抗体稀释度为 ),摇床过夜。洗膜,放入到二抗的稀释液(稀释度为 )中,室温孵育。二抗孵育完成后,洗膜。将 发光液均匀涂抹膜上,孵育 。将膜放入成像仪中,进行成像和拍照。检测细胞生长活性将 集中到 孔中,置于 的培养箱中 过夜培养,使细胞贴壁。待细胞处理完成,加入 溶液(孔),继续培养。采用酶标仪测定细胞溶液在
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