红景天苷通过上调端粒酶表达延缓小鼠脑衰老的作用机制.pdf
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1、 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ,实验研究 :基金项目:国家自然科学基金项目()作者单位:青岛市第六人民医院医学影像科,山东 青岛 ;青岛大学医学部中西医结合中心,山东青岛 ;青岛市第六人民医院肝脏肿瘤科,山东 青岛 通信作者:乔兵,:红景天苷通过上调端粒酶表达延缓小鼠脑衰老的作用机制杨光文倪钦帅朱琳乔兵郭云良【摘要】目的研究红景天苷对衰老小鼠海马组织的影响及作用机制。方法将 个月龄 小鼠 只自然衰老鼠,按随机数字表法分为老年组、环黄芪醇组(,阳性药物)、红景天苷低剂量组()、红景天苷高剂量组(),每组各 只。另取个月龄 小鼠 只作为青年组。老年组和青年组小鼠给予等体积生理盐水灌胃,其他
2、组给予对应药物灌胃。采用 水迷宫试验评价小鼠的学习和记忆能力,染色和 染色观察小鼠海马神经元损伤情况,检测端粒酶逆转录酶(,)及其激活因子 的表达水平,法检测端粒酶活性。结果水迷宫实验,老年组小鼠的逃逸潜伏期明显高于青年组小鼠,差异有统计学意义(),而在目标象限停留时间和跨过平台次数则明显少于青年组小鼠,差异有统计学意义()。与老年组比较,红景天苷组和环黄芪醇治疗组小鼠可有效降低逃逸潜伏期,差异有统计学意义(),在目标象限停留时间和跨过平台次数明显增加,差异有统计学意义()。老年组小鼠海马神经元数量较青年组小鼠显著减少,结构不清,排列紊乱,细胞核固缩深染,小体分布不均;给予红景天苷和环黄芪醇后
3、,小鼠海马神经元的形态结构均有不同程度的改善。与青年组小鼠比较,衰老小鼠海马组织的端粒酶活性明显降低,差异有统计学意义();红景天苷和环黄芪醇治疗后,衰老小鼠海马组织的端粒酶活性明显提高,差异有统计学意义()。与青年小鼠比较,衰老小鼠海马组织中的 和 的表达明显下降,差异有统计学意义(),经红景天苷和环黄芪醇处理的小鼠海马组织中 和 的表达较衰老小鼠明显升高,差异有统计学意义()。结论红景天苷可以通过提高端粒酶活性而延缓小鼠海马组织衰老。【关键词】红景天苷;衰老;端粒酶;端粒酶逆转录酶;小鼠【中图分类号】【文献标识码】,(,;,;,)【】(),(,),()()(),(),()(),(),(),
4、世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ,(),(),(),()【】;随着社会人口老龄化的进展,老年人群的认知功能备受关注 。端粒长度与衰老密切相关,衰老的标志之一是端粒逐渐缩短,缩短到一定长度就会引发持续的 损伤反应,导致细胞衰老和死亡 。端粒酶可以在染色体末端添加端粒重复序列来重新延长端粒,以补偿端粒磨损 。研究表明,端粒酶缺陷的小鼠伴随衰老表现出更明显的神经退行性变 。重新激活端粒酶可以改善与年龄相关的神经元损伤和认知能力 。端粒酶逆转录酶(,)是端粒酶的关键调节组分,的上调又受多种调节因子作用 ,其启动子含有多种转录因子结合位点 ,激活因子主要有原癌基因 (,)、核 因 子 (,)和雌激素
5、受体等 ,其中 是 转录的重要调节因子。王雪睿等 报道,氯化锂能够通过调控 抑制老年痴呆模型大鼠脑细胞的凋亡。曹 艳 玲 等 发 现,环 黄 芪 醇(,)是益气类中药黄芪的苷元,可通过提高衰老小鼠体内过氧化物气化酶的活性而发挥抗衰老作用,是神经元中一种有效的端粒酶激活剂 。红景天被称为“东方神草”和“高原人参”,与刺五加、人参等同属于补益中药 ,具有补气养血、清热润肺、益智养心等功效,广泛用于抗疲劳、抗氧化、抗炎和心脑血管疾病治疗,同时具有抗衰老的功效 ,千金翼方言之“久服通神不老 。”红景天苷(,)由红景天全草或根茎中分离,是红景天实现其效用的主要成分 。实验 证 明,红 景 天 苷 可 以
6、 改 善 学 习 和 认 知 能力 ,在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中具有重要作用 ,因而受到广泛关注。但红景天苷在神经系统衰老中的作用及其可能的机制尚不明确。本研究拟通过建立自然衰老小鼠模型,使用红景天苷进行干预,观察衰老小鼠学习记忆能力、海马神经元形态结构、端粒酶逆转录酶和端粒酶活性的变化,探讨红景天苷在衰老小鼠中的作用及可能的机制。材料与方法 材料 动物清洁级 个月龄雄性 小鼠 只,体重 ;清洁级 个月龄雄性 小鼠 只,体重 ,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物生产许可证号:(京),动物合格证号:。小鼠于清洁级动物房饲养,温度 ,湿度 ,自由饮食。动物实验由青岛大学医学部中西医
7、中心伦理委员会批准执行(审批号:)。试剂和仪器 (),纯度 ,购自上海源叶生物科技有限公司;(),纯度 ,购自上海源叶生物科技有限公司;端粒酶 试剂盒(),购 自 德 国 罗 氏 公 司;(,生 产 批 号:)、()(,生产批号:)抗体,购自美国 公司;抗体(,生产批号:),购自美国 公司;垂直电泳仪(),仪(),购自美国 公司;光学显微镜(),购自日本 公司;酶标仪(),购自美国 公司。方法 分组将 只 个月龄老年小鼠按照随机数表法分为老年组、环黄芪醇组()、红景天苷低剂量组()、红景天苷高剂量组(),每组各 只。另取 只 个月龄小鼠作为青年组。青年组和老年组小鼠给予等体积()量生理盐水灌胃
8、,次 ,连续 周。分别给予红景天苷低剂量组和红景天苷高剂量组 和 灌胃,次 ,连续 周。环黄芪醇组给予 灌胃,次 ,连续 周。动物实验过程严 世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ,格遵守动物伦理学要求。水迷宫实验动物给药结束 周后,采用 水迷宫()实验测试小鼠的学习和记忆能力。水池直径 ,高度 ,水温,水深 ,分为个象限。实验包括定位航行训练和空间探索实验。定位航行训练时,在一个象限中点的放置一个隐藏平台,小鼠面向池壁放入水中,自动录像系统记录小鼠找到并爬上平台所用时间(逃避潜伏期),准许小鼠在平台上停留 ,若小鼠 内未找到平台,则引导小鼠到平台上,每天每个象限重复次,所有小鼠训练 。在第 天
9、移除平台进行探索试验,将小鼠从平台象限的对角线象限面向池壁放入池中,每只小鼠探索 ,通过视频跟踪分析系统记录游泳轨迹、跨越平台次数和在目标象限停留时间。组织病理染色水迷宫实验结束后,各组小鼠经 水合氯醛腹腔注射()深度麻醉,经心脏灌注生理盐水和 多聚甲醛,完整取脑。常规酒精梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切成 厚的冠状海马组织切片。海马组织切片脱蜡和水化,根据 和 试剂盒说明染色,倒置显微镜采集海马 区图像(倍)。端粒酶活性检测用端粒酶 试剂盒提供的裂解液裂解小鼠海马组织,获得蛋白提取物,加入含有端粒酶底物的反应混合物中,转移到 仪,反应条件:,个循环,。产物用杂交缓冲液稀释后,转移到预先涂有
10、端粒重复特异性地高辛标记探针的 孔板中,变性杂交 。随后加入抗地高辛过氧化物酶偶联物和 底物,酶标仪测定 处的吸光度。经热灭活的提取物作为阴性对照,试剂盒中提供的蛋白提取物作为阳性对照。根据阴性对照的值,吸光度值 的样品为阳性。检测分离小鼠海马组织,使用 裂解液裂解获得组织蛋白,法检测蛋白浓度。每组取 蛋白经 凝胶电泳分离,然后电转移到 膜。用 脱脂牛奶在室温封闭 。冲洗膜后,加入一抗(,)孵育过夜。冲洗膜后,加入羊抗兔二抗 ()室温反应 ,化学发光()显色,软件分析,计算蛋白的相对表达量。统计学方法采用 统计学软件统计分析,符合正态分布的数据以均数 标准差()表示,多组间比较采用单因素方差分
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