红芸豆miR395家族成员的鉴定及其与结瘤相关的表达分析.pdf
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1、山西农业科学 2023,51(10):1170-1177Journal of Shanxi Agricultural Sciences红芸豆 miR395家族成员的鉴定及其与结瘤相关的表达分析王东梅,孙丽丽,郑江涛,王利祥,郭数进(山西农业大学 农学院,山西 太谷 030801)摘要:microRNA395 是高等植物保守的 miRNA 家族,主要通过靶向低亲和力硫酸盐转运蛋白(AST)和 ATP磺酰化酶(APS)来响应植物的硫饥饿反应,硫饥饿会显著影响固氮植物的结瘤共生固氮过程。为解析 miR395在豆科植物结瘤共生固氮中的作用,对红芸豆 miR395家族成员进行生物信息学预测,并对 pvu
2、-miR395在红芸豆不同组织和根瘤菌侵染不同时间段进行差异表达分析。结果显示,在全基因组水平上鉴定出 8个 pvu-miR395的家族成员,位于第 2、3号染色体上。pvu-miR395家族成员成熟序列和星标序列高度保守,它们的前体序列均可生成稳定的二级结构。进一步对芸豆与大豆、苜蓿、拟南芥、水稻 miR395 家族成员进行系统进化分析,可将miR395家族成员分为 Group 4个亚家族。顺式作用元件分析发现,该家族成员可能参与植物激素、胁迫、生长和发育等过程;qRT-PCR 差异表达分析发现,pvu-miR395家族成员均在根瘤中表达量最高,具有组织特异性,且 pvu-miR395的表达
3、量随根瘤菌处理时间延长呈现先升高后降低的趋势,显著抑制根瘤菌的侵染。靶基因预测表明,硫酸盐转运蛋白和硫酸腺苷酰基转移酶可能是 pvu-miR395的靶基因。关键词:红芸豆;miR395;生物信息学分析;靶基因;结瘤;表达分析中图分类号:S643 文献标识码:A 文章编号:10022481(2023)10117008Identification of miR395 Family Members and Their Nodulation Relevant Expression Analysis in Red Kidney BeanWANG Dongmei,SUN Lili,ZHENG Jiangt
4、ao,WANG Lixiang,GUO Shujin(College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)Abstract:MicroRNA395 is a conserved miRNA family in higher plants,which mainly responses to sulfur starvation by targeting low affinity sulfate transporter(AST)and ATP sulfonylases(APS).Sulfur starvat
5、ion significantly affects the process of nodulation and symbiotic nitrogen fixation of nitrogen fixing plants.To elucidate the role of miR395 in nodulation and symbiotic nitrogen fixation in leguminous plants,in this study,bioinformatics prediction was performed on the member of pvu-miR395 family me
6、mbers in red kidney bean,and differential expression analysis of pvu-miR395 in different tissues and at different periods of rhizobium infection was conducted.The results showed that eight members of miR395 family were identified in whole genome level,located on chromosomes 2 and 3.The mature and st
7、ar sequences of miR395 family members in red kidney bean were highly conserved,and their precursor could generate stable secondary structures.Further phylogenetic analysis of miR395 family members in Phaseolus vulgaris,Glycine max,Medicago truncatula,Arabidopsis thaliana,and Oryza sativa were conduc
8、ted to divide the members into four subfamilies(Group -).cis-acting element analysis revealed that the family members might be involved in plant hormones response,stress response,plant growth,and development.qRT-PCR differential expression analysis showed that pvu-miR395 family members had the highe
9、st expression levels in nodules with tissue specificity.The expression of pvu-miR395 increased first and then decreased with the treatment time of rhizobium,significantly inhibiting rhizobium infection.Target gene prediction showed that sulfate transporter and adenylyl sulfate transferase might be t
10、he target genes of pvu-miR395.Key words:red kidney bean;miR395;bioinformatics analysis;target genes;nodulation;expression analysis芸豆(Phaseolus vulgaris.L)是世界上最重要的经济豆类作物之一,是豆科植物菜豆属籽食性作物doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.10.08收稿日期:2023-07-22基金项目:国家自然科学基金项目(32241046);山西省科技重大专项(202101140601027);山西省科技创
11、新人才团队项目(202204051001020);山西省基础研究计划项目(20210302123365)作者简介:王东梅(1997-),女,河北张北人,在读硕士,研究方向:大豆遗传育种。通信作者:郭数进(1979-),男,山西太谷人,副教授,博士,主要从事大豆遗传育种研究工作。1170王东梅等:红芸豆 miR395家族成员的鉴定及其与结瘤相关的表达分析的总称。芸豆富含多酚化合物,多酚是具有有效抗氧化特性的次生代谢物,有助于减少氧化应激引起的疾病1。红芸豆富含维生素 C,钙和铁含量高,蛋白质含量和 B 族维生素含量高于鸡肉;红芸豆富含花色苷和皂苷,有降低关节局部炎性组织和缓解疼痛的功效,因此,红
12、芸豆是人们的理想食材,也是山西粮食出口的特色产品2-4。红芸豆结瘤固氮,是倒茬养地的重要作物,必将在种植业结构调整、居民膳食结构改善及区域粮食基本自给中发挥重要的作用;固氮不仅是保障红芸豆高产的关键,也是防止氮肥过度施用减轻环境问题的关键作物5-7。近些年,许多研究报道了 microRNA 调节豆科植物的结瘤固氮过程,比如在蒺藜苜蓿中,mtr-miR156 通过影响苜蓿的固氮效率和苜蓿根系的再生能力调节固氮8;在大豆中,gma-miR172c 通过靶向下游的 NNC1 来调节大豆结瘤起始9;在花生 中,ahy-miR399、ahy-miR159 和 ahy-miR3508等 microRNA
13、都参与调控花生结瘤10。MicroRNA(miRNA)是一类常见于真核生物中的内源性非编码 RNA,一般由 2022 个核苷酸组成11。在植物中,miRNA 通常与靶基因内的互补位点结合,实现在转录后水平抑制靶基因的表达,从而调节植物生长、发 育 和 对 逆 境 的 响 应。研 究 发 现,拟 南 芥miR395 通过靶向调控 ATP 磺酰化酶(APS)编码基因表达而影响其硫酸盐的积累和分配12;水稻miR395靶向抑制硫酸盐转运蛋白基因(AST)的表达,促进硫酸盐积累,miR395过表达的株系中表现出对细菌病原体的广谱抗性13。值得注意的是,miR395 是调节硫吸收和转运的关键调节因子,而
14、硫元素作为植物的必需营养素,是一些氨基酸、金属 辅 因 子、辅 酶 和 次 生 代 谢 产 物 的 关 键 组 成 元素14。硫饥饿会影响植物的生长、光合作用和产量。在 豆 科 植 物 中,硫 吸 收 正 向 调 控 结 瘤 固 氮(SNF),硫饥饿会导致结瘤减少、抑制固氮效率和降低根瘤代谢等现象15,因此,推测其可能参与调节豆科植物的共生结瘤过程。为探明 miR395家族成员是否响应根瘤菌的侵染调控共生结瘤,本研究利用生物信息学对芸豆的miR395 家族成员(pvu-miR395)进行全基因组鉴定,并对其染色体分布、碱基保守性、二级结构进行系统分析,预测 pvu-miR395 家族成员的启动
15、子顺式作用元件和靶基因,并利用实时荧光定量 PCR检测 pvu-miR395家族成员在红芸豆根瘤的表达和对根瘤菌侵染的响应情况,旨在为进一步深入研究pvu-miR395家族在芸豆生长发育和结瘤固氮中的生物学功能提供理论基础。1 材料和方法1.1材料供试红芸豆品种是品金芸 4号,由山西农业大学农业基因资源研究中心畅建武研究员和郝晓鹏博士提供。1.2方法1.2.1芸豆miR395的全基因组鉴定从PmiREN16数据库(https:/ miR395 的序列及结构分析根据在PmiREN 数据库下载的 pvu-miR395家族成员成熟序列和星标序列,利用 MEGA-X 软件对其进行序列比对,然后通过We
16、bLogo(https:/weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分析 pvu-miR395家族成员成熟序列和星标序列的碱基保守性。使用RNAfold(http:/rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNA-fold.cgi)预测 pvu-miR395前体的二级茎环结构,采用折叠算法选择最小自由能和分配函数。1.2.3构建 pvu-miR395 家族的进化树从 PmiREN数据库中下载大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryz
17、a sativa)的 miR395 家族成员的前体序列,利用 MEGA-X软件构建 pvu-miR395家族成员前体序列和以上 4 个物种的 miR395 前体序列的进化树,采用最大似然法计算,系统参数设置为默认值。1.2.4pvu-miR395家族成员的启动子顺式作用元件分析在PmiREN数据库下载pvu-miR395家族成员的上游2 000 bp作为其启动子序列,输入PlantCARE(https:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/pla-ntcare/html/)在线数据网站,对其顺式作用元件进行预测分析。利用 TBtools 软件对 pvu-m
18、iR395 基因家族顺式作用元件进行分析并绘制热图。1.2.5pvu-miR395靶基因预测使用 psRNATarget(https:/www.zhaolab.org/psRNATarget/)预测pvu-miR395 的靶基因,系统参数设置为默认值。选取最大期望值2的基因作为靶基因,分析 pvu-miR395 与候选靶基因的相互作用位点。此外,使用Phytozome 数据库(https:/phytozome-next.jgi.doe.gov)对所预测的靶基因进行功能注释。1171山西农业科学 2023 年第 51 卷第 10 期1.2.6RNA 提取和 qRT-PCR 分析红芸豆培养至长出三
19、出复叶,用 OD600=0.08 的芸豆根瘤菌 R.etli CFN42(Bradyrhizobium etli)17处理红芸豆幼苗,采集接菌 28 d后的根、叶和根瘤组织,检测 pvu-miR395 基因家族成员在这 3 个组织中的相对表达水平。同时,采集接菌后 0、1、3、6、12、24 h 的根组织,检测 pvu-miR395 基因家族在这 6 个时间点的相对表达水平。用 Trizol法提取芸豆的 RNA18,通过 1%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪检测 RNA 纯度和含量。使用反转录试剂盒 TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis Su
20、perMix 将 其 反 转 录 为cDNA。以 cDNA 为模板进行 qPCR 检测,上游的特异引物根据所检测的 miR395成熟序列进行设计(表 1),下游的引物均为反转录试剂盒自带引物Universal miRNA qPCR Primer,用 U6 作为内参基因19。实时荧光定量 PCR采用试剂盒 PerfectStart Green qPCR SuperMix,根 据 说 明 书 对 样 品 进 行qRT-PCR操作。1.3数据分析按照公式(2Ct,CtCt 目标基因-Ct 内参基因)进行数据分析,为了保证试验的准确性,每个样品 3 个技术重复。设定处理前(0 h)的材料数据为对照进行
21、相对表达量分析。2 结果与分析2.1pvu-miR395家族成员的鉴定及染色体定位分析为系统鉴定 pvu-miR395 家族成员,本研究从PmiREN 数据库搜索共获得位于芸豆基因组的8个 miR395家族成员,分别命名为 pvu-miR395apvu-miR395h(表 2)。其中,pvu-miR395 家族成员的成熟序列和星标序列均含有 21 个碱基,成熟序列比对结果显示,pvu-miR395a、pvu-miR395b 和pvu-miR395c高度保守,pvu-miR395e、pvu-miR395f和 pvu-miR395g 高度保守(图 1-A)。星标序列比对结果同样显示其碱基高度保守(
22、图 1-B)。pvu-miR395 家族分布在第 2 号和第 3 号染色体上,其中,第 2 号 染 色 体 上 包 含 pvu-miR395395a、pvu-miR395b、pvu-miR395c 和 pvu-miR395d 等 4 个成 员,其 余 的 pvu-miR395e、pvu-miR395f、pvu-miR395g和 pvu-miR395h位于第 3号染色体上。表 1 研究所用的引物序列Tab.1 Primer sequence in this study引物名称Primer namepvu-miR395a/b/c-Fpvu-miR395d-Fpvu-miR395e/f/g-Fpvu
23、-miR395h-FU6-FU6-R引物序列(5 3)Primer sequence(5-3)TGAAGTGTTTGGGGGAACTCCTGAAGTGTTTGGGGGAACTTGAAGTGTTTGGGGGAACTTTTTGAAGTGTTTGGAGGAACTCGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATTTGGACCATTTCTCGAT碱基数/ntBase number202021212418表 2 pvu-miR395家族成员的基本信息Tab.2 Basic information of pvu-miR395 family membersmiRNApvu-miR395apvu-miR39
24、5bpvu-miR395cpvu-miR395dpvu-miR395epvu-miR395fpvu-miR395gpvu-miR395h染色体位置Chromosomal locationChr02:15185640.15185767(+)Chr02:15192303.15192432(+)Chr02:15209069.15209198(+)Chr02:15107303.15107418(-)Chr03:10232276.10232383(+)Chr03:10237903.10238046(+)Chr03:10250834.10250975(+)Chr03:10266377.10266509(-
25、)成熟 miRNAMature miRNATGAAGTGTTTGGGGGAACTCTTGAAGTGTTTGGGGGAACTCTTGAAGTGTTTGGGGGAACTCTCTGAAGTGTTTGGGGGAACTCTGAAGTGTTTGGGGGAACTTTTGAAGTGTTTGGGGGAACTTTTGAAGTGTTTGGGGGAACTTTTTGAAGTGTTTGGAGGAACTC星标序列Star sequenceAGTTCCTCTGAACGCTTCATCAGTTCCTCTGATCACTTCATTAATTCCCCTGACCACTTCTTTGTTCCCTTGAACGCTTCATTGAGTTCCTCTG
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