DB21∕T 2549-2015 仔猪乳糖酶基因检测技术规程.pdf
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1、ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 25492015 仔猪乳糖酶基因检测技术规程 Method of detecting lactase gene in piglets 20151215 发布 20160215 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 25492015 1 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准给出的规则制定。 附录A、附录B和附录C均为规范性附录。 本标准由辽宁医学院提出。 本标准由锦州市质量技术监督局归口。 本标准起草单位:辽宁医学院。 本标准主要起草人:田玉民、苏玉虹、朱弘焱、陶晓丽、王 希。 DB21/T 2549
2、2015 2 仔猪乳糖酶基因检测技术规程 1 范围 本标准规定了仔猪乳糖酶基因启动子和增强子多态性的检测条件、检测步骤和结果判定的技术要求。 本标准适用于仔猪乳糖酶基因检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测实验室技术要求 GB/T 27476.1-2014 检测实验室安全 第1部分:总则 3 术语和定义 3.1 乳糖酶基因 Lacta
3、se gene, LCT 乳糖酶(LCT)又称-半乳糖苷酶,在特定条件下将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,进而被消化道吸收。仔猪的乳糖酶基因位于染色体15q13,预测CDS全长为5 793 bp,在基因序列数据库(GenBank)中的登录号为XM_003359430。 4 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2第七章规定执行。 5 安全防护 实验室安全防护按GB/T 27476.1第五章规定执行。 6 检测条件 6.1 实验室条件 按GB/T19495.2中的规定执行。 6.2 扩增仔猪乳糖酶基因片段的 PCR 引物 DB21/T 25492015 3 扩增启动子 SN
4、P G-308C 和 A-301G 片段的 PCR 引物: 上游引物F:5-AAA AAG TTT GGT AAG GAC CT-3; 下游引物R:5-GGA ACT GTT AGG AGG TAT GTG-3 扩增增强子 SNP G-797A 片段的 PCR 引物: 上游引物F:5-TAA ACA AAG CCA AGG ACA TT-3; 下游引物R:5-CTG GGG TGT ATG TGC TTG TGG-3 6.3 主要试剂 用水应符合GB/T 6682的灭菌双蒸水。 裂解液、10% SDS、饱和酚、TE缓冲液、2 Pfu PCR Master Mix、蛋白酶K、凝胶回收纯化试剂盒、
5、测序试剂盒等。具体配制方法参见附录 A。 6.4 主要仪器 微量移液器、高速冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、PCR热循环仪、pH计、精度0.1 g分析天平、涡旋混合仪、电泳仪、全自动DNA测序仪等。 7 检测步骤 7.1 样品的采集 用猪耳号钳子夹取仔猪耳部边缘组织0.5 cm3,立即置于装有75%乙醇的1.5 mL Ep白色塑料管中,-20保存备用。 7.2 仔猪基因组 DNA 提取 采用常规的酚-三氯甲烷法提取,并测定DNA溶液浓度。具体方法参见附录 B。 7.3 乳糖酶基因 5UTR 区启动子 SNP G-308C 和 A-301G 的检测 15 L反应体系:DNA模板50 ng、10 mo
6、l/L 上下游引物各1 L、2 Pfu PCR Master Mix 7.5 L、加灭菌双蒸水至15 L。可根据需要调整反应体系(注:为保证实验准确性,需设置以灭菌双蒸水为模板的PCR反应作为阴性对照)。PCR扩增产物长度为318 bp。 PCR反应循环参数:94 预变性5 min;94 变性30 s,52 退火30 s,72 延伸30 s,30个循环;72 延伸10 min,4保存。 用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0凝胶回收纯化试剂盒对PCR产物纯化。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA
7、 Extraction Kit Ver.4.0测序试剂盒对PCR产物测序反应。然后在ABI 3730XL全自动DNA测序仪进行毛细管电泳和序列测定,获得序列色谱图ABI文件。通过Sequencing Analysis 和Sequencher软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的判读。 7.4 乳糖酶基因5UTR区增强子SNP G-797A的检测 DB21/T 25492015 4 15 L反应体系:DNA模板50 ng、10 mol/L 上下游引物各1 L、2 Pfu PCR Master Mix 7.5 L、加灭菌双蒸水至15 L。可根据需要调整反应体系(注:为保证实验准确性,需设置以
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