DB12∕T 505-2014 玉米转基因成分筛查方法.pdf
《DB12∕T 505-2014 玉米转基因成分筛查方法.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB12∕T 505-2014 玉米转基因成分筛查方法.pdf(9页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、B 04 ICS 65.020.01 天津市地方标准 DB12DB12/T 5052014 玉米转基因成分筛查方法 Screening method for genetically modified maize 2014-04-22 发布 2014-07-20 实施天津市质量技术监督局发布 天津市质量技术监督局发布 DB12/T 5052014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由天津市质量技术监督局提出。 本标准起草单位:天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。 本标准主要起草人:黄凤军、李建、赵新、陈杰、易萌、朱珠、马强、
2、杨炳存。 本标准 2014 年 04 月首次发布。 DB12/T 5052014 1 玉米转基因成分筛查方法 1 范围 本标准规定了玉米中转基因成分定性 PCR 筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。 本标准适用玉米及其制品中 zSSIIb 内标准基因、CaMV35S 启动子、NOS 终止子、Bt 基因、bar基因、HPT 基因的定性 PCR 筛查检测 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T
3、672 转基因植物及其产品检测 通用要求 农业部 2031 号公告192013 转基因植物及其产品检测 抽样 农业部 1485 号公告42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 zSSIIb 基因基因 zSSIIb gene 编码玉米淀粉合酶异构体 zSTS-2 的基因。 3.2 CaMV 35S 启动子 35S promoter from cauliflower mosaic virus (CaMV) 来自花椰菜花叶病毒的 35S 启动子。 3.3 NOS 终止子 terminator of nopaline syntha
4、se (NOS) gene 来自胭脂碱合成酶基因 NOS 的终止子。 3.4 Bt 基因 Bt(Bacillus thuringiensis)gene 来源与苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),可表达一种杀虫晶体蛋白的基因,常见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。 3.5 bar 基因 bialaphos resistance gene 来源于土壤吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus),编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinthricin acetyltransferase,PA
5、T)。该酶具有对除草剂草丁膦(glufosinate)的耐受性。 3.6 HPT 基因基因 HPT gene 来源于大肠杆菌或链球菌(Streptomyceshy groscopicus) ,编码潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase)的基因。 DB12/T 5052014 2 4 检测方法 4.1 试剂和材料 4.1.1 实验用水为重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1.2 琼脂糖。 4.1.3 10 g/L 溴化乙锭溶液:称取 1.0 g 溴化乙锭(EB),溶于 100 mL 水中,避光保存。 注:溴化乙锭有致癌作用,配制和使用时应
6、戴一次性手套操作并妥善处理废液。 4.1.4 10 mol/L 氢氧化钠溶液:在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠(NaOH),溶解后再加水定容到 200 mL。 4.1.5 500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8.0): 称取 18.6 g 乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2) ,加入 70 mL 水中,再加入适量氢氧化钠溶液(4.1.4),加热至完全溶解后,冷却至室温,用氢氧化钠溶液(4.1.4)调 pH 至 8.0,加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa(121 )条件下灭菌 20 min。 4.1.6 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(p
7、H 8.0):称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于 800 mL 水中,用盐酸调 pH 至 8.0,加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa(121 )条件下灭菌 20 min。 4.1.7 TE 缓冲液(pH 8.0):分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(4.1.6)和 2 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液(4.1.5),加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa(121 )条件下灭菌 20 min。 4.1.8 50TAE 缓冲液:称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用 300 mL 水加热搅拌溶解后,加 100 mL 乙
8、二铵四乙酸二钠溶液(4.1.5),用冰乙酸调 pH 至 8.0,然后加水定容到 1 000 mL。使用时用水稀释成 1TAE。 4.1.9 加样缓冲液:称取 250.0 mg 溴酚蓝,加 10 mL 水,在室温下溶解 12 h;称取 250.0 mg 二甲基苯腈蓝,用 10 mL 水溶解;称取 50.0 g 蔗糖,用 30 mL 水溶解。混合以上三种溶液,加水定容至 100 mL,在 4 下保存。 4.1.10 DNA 分子量标准:可以清楚的区分 50 bp1 000 bp 的 DNA 片段。 4.1.11 dNTPs 混合溶液:将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、
9、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。 4.1.12 Taq DNA 聚合酶、PCR 反应缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁溶液。 4.1.13 引物引物:玉米内标准基因和转基因玉米外源基因检测时所用的引物序列见表 1。 表 1 玉米内标准基因和转基因玉米外源基因引物序列 检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因性质 zSSIIb zSSIIb -F:5- CTCCCAATCCTTTGACATCTGC -3 zSSIIb -R:5- TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG -3 151 bp 内标准基因 CaMV 35S 35S -F:5-GCTCCTACAAATGCCATCAT
10、TGC-3 35S -R:5-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 195 bp 外源基因 NOS NOS -F:5-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3 NOS -R:5-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 180 bp 外源基因 Bt Bt -F:5- GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC -3 Bt -R:5- CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3 301 bp 外源基因 bar bar -F:5- GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 bar -R:5- CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3 262 bp 外源基因
11、DB12/T 5052014 3 HPT hpt -F:5- GAAGTGCTTGACATTGGGGAGT -3 hpt -R:5- AGATGTTGGCGACCTCGTATT -3 472 bp 外源基因 4.1.14 引物溶液:用 TE 缓冲液(4.1.7)或水分别将上述引物稀释到 10 mol/L。 4.1.15 石蜡油石蜡油。 4.1.16 PCR 产物回收试剂盒。 4.1.17 DNA 提取试剂盒。 4.2 仪器 4.2.1 分析天平:感量 0.1 g 和 0.1 mg。 4.2.2 PCR 扩增仪:升降温速度1.5 /s,孔间温度差异1.0 。 4.2.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置
12、。 4.2.4 紫外透射仪。 4.2.5 凝胶成像系统或照相系统。 4.2.6 重蒸馏水发生器或纯水仪。 4.2.7 其他相关仪器设备。 4.3 分析步骤 4.3.1 抽样 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告192013 规定的执行。 4.3.2 试样准备 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告192013 规定的执行。 4.3.3 试样预处理 按农业部 1485 号公告42010 规定的执行。 4.3.4 DNA 模板制备 按农业部 1485 号公告42010 规定的执行。 4.3.5 PCR 反应 4.3.5.1 试样 PCR 反应 4.3.5.1.1 每个试样 P
13、CR 反应设置 3 次重复。 4.3.5.1.2 在 PCR 反应管中按表 2 依次加入反应试剂, 混匀, 再加 25 L 石蜡油 (有热盖设备的 PCR仪可不加) 。 表 2 PCR 检测反应体系 试剂 终浓度 体积 水 10PCR 缓冲液 1 2.5 L DB12/T 5052014 4 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液(各 2.5 mmol/L) 各 0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L 上游引物 0.10.5 mol/L 0.251.25 L 10 mol/L 下游引物 0.10.5 mol/L 0.251.25 L
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB12T 505-2014 玉米转基因成分筛查方法 DB12 505 2014 玉米 转基因 成分 方法
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【da****hi】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【da****hi】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。