SZDB∕Z 132-2015 小反刍兽疫抗体检测 竞争酶联免疫吸附法.pdf
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1、 SZDB/Z 132-2015 1 深 圳 市 标 准 化 指 导 性 技 术 文 件 SZDB/Z SZDB/Z 132-2015 小反刍兽疫抗体检测 竞争酶联免疫 吸附法 Detection Method of Competitive enzyme-linked immunosorbent assay for Peste des petits ruminants 2015-02-27 发布 2015-03-01 实施 发布 深 圳 市 市 场 监 督 管 理 局 ICSICS 11.22011.220 B B 4141 SZDB/Z 132-2015 I 目 次 前 言 . II 1 范
2、围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 原理 . 1 4 缩略语 . 1 5 试剂和材料 . 2 6 主要器械和设备 . 2 7 PPRV 重组 N 蛋白抗原的制备 . 3 8 PPRV 单克隆抗体的制备 . 4 9 待测样品的采集和处理 . 5 10 竞争酶联免疫吸附(C-ELISA)试验 . 6 附录 A . 8 SZDB/Z 132-2015 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由深圳市检验检疫科学研究院提出。 本标准起草单位:深圳市检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心。 本标准主要起草
3、人:阮周曦、曾少灵、唐金明、花群义、吕建强、杨俊兴、曹琛福、卢体康、廖立珊、陈兵、孙洁、叶奕优、黄超华、马春伟、陈淼、程思。 SZDB/Z 132-2015 1 小反刍兽疫抗体检测 竞争酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了检测小反刍兽疫抗体检测竞争酶联免疫吸附法及其试剂制备方法。 本标准适用于小反刍兽疫抗体检测、监测和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2123 出入境动物
4、检疫实验样品采集、运输和保存规范 中国兽药典第三部附录 3 原理 酶联免疫吸附试验是由酶分子与抗体分子共价结合形成酶标记抗体, 此种结合不会改变抗体的免疫学特性, 也不影响酶的生物学活性。 通过此种酶标记抗体与吸附在固相载体上的抗原发生特异性结合, 当加入底物溶液后, 底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,从而出现显色反应,此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定,从而通过底物的显色反应来判定有无相应的免疫反应。本标准竞争酶联免疫吸附试验则是在ELISA板上包被小反刍兽疫病毒重组N蛋白的制备特异性抗原, 然后加入待检血清和抗小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体, 如果待检血清中
5、存在小反刍兽疫病毒N蛋白抗体, 就会竞争性地与包被抗原发生反应。 如果待检血清中抗体越多, 则特异性单克隆抗体与包被抗原结合的就相对少,从而最终的显色反应就浅。因待检血清中抗体的含量与颜色呈反比,所以可通过显色反应酶标仪读数的方式判定待检血清中是否有小反刍兽疫病毒抗体。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PPR:小反刍兽疫。 PPRV:小反刍兽疫病毒。 C-ELISA:竞争酶联免疫吸附试验。 SZDB/Z 132-2015 2 PPRV-N蛋白:小反刍兽疫病毒核蛋白。 AcNPV:苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒。 sf9 细胞:草地夜蛾卵巢细胞。 pfu:蚀斑形成单位。 r/min:转速单位,转
6、/分。 IMDM:伊思柯夫改良培养液。 SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 PI:抑制百分率。 5 试剂和材料 a)包被抗原:PPRV重组N蛋白表达抗原。 b)单克隆抗体:抗PPRV-N蛋白特异性单克隆抗体。 c)实验动物:10周龄左右SPF级BAL B/c雌鼠。 d)标准血清:小反刍兽疫标准阳性血清、弱阳性血清、阴性血清,由世界动物卫生组织(OIE)参考实验室或中国农业部指定实验室提供。 e)待测血清:动物血清56灭能30min。 f)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG(HRP 标记的羊抗鼠 IgG):按说明书指定的工作浓度稀释使用。 g)包被液、洗涤液、稀释液、底物液/
7、显色剂、终止液:配制方法见附录 A。 h)水:符合GB/T 6682分析实验室二级水规格。 i)可拆96孔酶标板。 6 主要器械和设备 恒温摇床; 真空冻干机; 台式高速离心机; 凝胶成像系统; CO2恒温箱; 多波段酶标仪; 洗板机; SZDB/Z 132-2015 3 超声波破碎仪; 单孔道、多孔道可调微量移液器(1L、50L 、100L、1000L)、微量滴头; 紫外分光光度计。 7 PPRV 重组 N 蛋白抗原的制备 7.1 种毒 为携重组昆虫杆状病毒 AcNPV-PPRV-N 株,为携带小反刍兽疫病毒 N 基因的 pFast HTA-PPRV-N 重组质粒转座 DH10Bac, 提取
8、杆粒转染 sf9 昆虫细胞获得。 由深圳市检验检疫科学研究院构建、鉴定、保管和供应。 7.2 种毒含量测定 7.2.1 用含10%胎牛血清的Graces培养基重悬sf9昆虫细胞, 调整细胞浓度为5105个细胞/mL,加入6孔板,每孔2mL细胞悬液,置CO2恒温培养箱27培养24h,用Graces培养基洗涤细胞2次。 7.2.2 取种毒病毒液,用Graces培养基由10-1开始作10倍系列稀释,取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8病毒液体,各加两孔,每孔1mL,做好标记。培养2h后收取菌液。 7.2.3 6孔培养板置27孵育1h,吸取培养板中病毒液弃去,加入40水浴的含4
9、%琼脂糖、20%胎牛血清的2x Graces培养基,置CO2恒温培养箱27培养7d10d,观察并进行蚀斑计数。 7.2.4 按照病毒滴度=蚀斑数病毒稀释倍数/每孔体积数mL进行计算;病毒含量应1.0106pfu/mL。 7.3 病毒繁殖和培养 7.3.1 将保存的昆虫杆状病毒AcNPV-PPRV-N株种毒,按110比例接种于长成单层的sf9昆虫细胞,在2%胎牛血清的Graces培养基中27培养7296h,待出现80%细胞病变,收获病毒液作为生产用种子病毒。 7.3.2 取生产用种毒按110接种于长成单层的sf9昆虫细胞,扩大培养,27下培养96120h后,出现80%细胞病变,收获细胞悬液。 7
10、.4 PPR-N蛋白抗原的纯化 7.4.1 取收获细胞悬液, 置80冰箱, 反复冻融3次, 以25KHz超声波破碎50次, 每次20s,间隔30s,8000r/min离心30min,收获上清液。 SZDB/Z 132-2015 4 7.4.2 在35000r/min超速离心120min, 按超速离心前体积的1/100, 用灭菌pH7.2的PBS溶解沉淀蛋白,加入硫柳汞至终浓度为0.01%,按0.5g/mL 加入leupeptin(亮抑酶肽)蛋白酶抑制剂,按0.5mL/管分装,真空冻干保存。 7.5 PPRV重组N蛋白抗原的检验及贮藏 7.5.1 性状 PPRV重组N蛋白抗原应为白色固体,无臭、
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