SZDB∕Z 131-2015 非洲猪瘟病毒抗体检测 阻断酶联免疫吸附法.pdf
《SZDB∕Z 131-2015 非洲猪瘟病毒抗体检测 阻断酶联免疫吸附法.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《SZDB∕Z 131-2015 非洲猪瘟病毒抗体检测 阻断酶联免疫吸附法.pdf(13页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、 SZDB/Z131-2015 1 深 圳 市 标 准 化 指 导 性 技 术 文 件 SZDB/Z SZDB/Z 131-2015 非洲猪瘟病毒抗体检测 阻断酶联免疫吸附法 Detection method of blocking enzyme-linked immunosorbent assay for African swine fever 2015-02-27 发布 2015-03-01 实施 发布 深 圳 市 市 场 监 督 管 理 局 ICS 11.220 B 41 SZDB/Z131-2015 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 原理
2、. 1 4 缩略语 . 1 5 试剂和材料 . 2 6 主要器械和设备 . 2 7 非洲猪瘟病毒 p54 抗原的制备 . 2 8 HRP 标记的单克隆抗体的制备 . 3 9 阻断 ELISA 试验. 4 10 结果判定 . 6 附录 A . 错误!未定义书签。错误!未定义书签。 附录 B . 错误!未定义书签。错误!未定义书签。 SZDB/Z131-2015 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准的附录A为规范性附录,附录B为资料性附录。 本标准由深圳市检验检疫科学研究院提出。 本标准起草单位:深圳市检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫
3、技术中心。 本标准主要起草人:曹琛福、花群义、吕建强、杨俊兴、宗卉、林庆燕、阮周曦、张彩虹、刘建利、孙洁、陶虹、廖立珊、唐金明、陈书琨、叶奕优、黄超华。 SZDB/Z131-2015 1 非洲猪瘟病毒抗体检测 阻断酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了检测非洲猪瘟抗体的阻断酶联免疫吸附试验方法及其试剂制备方法。 本标准适用于非洲猪瘟抗体检测、流行病学调查和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 S
4、N/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 中国兽药典第三部附录 3 原理 酶联免疫吸附试验的酶标记抗体是由酶分子与抗体分子共价结合形成, 此种结合不会改变抗体的免疫学特性, 也不影响酶的生物学活性。 通过此种酶标记抗体与吸附在固相载体上的抗原发生特异性结合, 当加入底物溶液后, 底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,从而出现显色反应,此种显色反应可通过酶标仪进行定量测定,从而判定有无相应的免疫反应。 本标准阻断酶联免疫吸附试验则是在ELISA板上包被非洲猪瘟病毒p54重组蛋白特异性抗原, 然后加入待检血清, 如果待检血清中存在非洲猪瘟病毒p54蛋白
5、抗体,就会与包被抗原发生反应,从而阻断下一步酶标抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体与包被抗原结合。如果待检血清中抗体越多,则酶标单抗与包被抗原结合的就少,从而最终的显色反应就越浅,因此可通过酶标仪读数来判定待检血清样品中抗体的含量。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ASF:非洲猪瘟。 ASFV:非洲猪瘟病毒。 bELISA:阻断酶联免疫吸附试验。 McAb:单克隆抗体。 IPTG:异丙基硫代- -D-半乳糖苷。 SZDB/Z131-2015 2 PEG:聚乙二醇。 SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 PI:阻断百分率。 HRP:辣根过氧化物酶。 5 试剂和材料 a)
6、主要菌株与质粒:pET-52b(+) 3C/LIC-p54重组表达质粒(含ASFV p54目的基因,片段大小为552 bp);感受态细胞BL21(DE3);杂交瘤细胞株。 b) 主要试剂:LB培养基;PCR反应母液;琼脂糖凝胶;IPTG;氨苄青霉素;细菌细胞蛋白裂解液;液体石蜡;胎牛血清;IMDM基础培养液;ELISA包被液;封闭液;稀释液;显色液;终止液。具体配制方法见附录A。非洲猪瘟标准阴性血清、阳性血清。 c) 主要耗材:灭菌移液器吸头;灭菌1.5 mL离心管;培养皿;硝酸纤维素膜;ELISA板。 d) 实验动物:10周龄SPF级BALB/c雌鼠。 6 主要器械和设备 恒温摇床; 电泳仪
7、; 台式高速离心机; 凝胶成像系统; PCR扩增仪; 酶标仪; 洗板机; 超声波破碎仪; 微量移液器(10 L、100 L、1000 L量程各一支); 真空冻干机; 紫外分光光度计 7 非洲猪瘟病毒 p54 抗原的制备 7.1 质粒 为携带非洲猪瘟病毒 p54 基因的 pET-52b(+) 3C/LIC-p54 重组表达质粒,由深圳市检验检疫科学研究院构建、鉴定、保管和供应。 SZDB/Z131-2015 3 7.2 ASFV p54基因的检验 采用引物对(上游引物序列为5-ATGGATTCTGAATTTTTTCA- 3,下游引物序列为5-GTTCAAGGAGTTTTCTAGGTC-3)对pE
8、T-52b(+) 3C/LIC-p54重组表达质粒进行扩增,应扩增出552 bp的特异性条带,具体核苷酸序列可参考附录B。 7.3 ASFV p54 蛋白抗原的表达、纯化与检验 7.3.1 ASFV p54蛋白表达 将含pET-52b(+) 3C/LIC-p54重组表达质粒载体的BL21(DE3)宿主细胞,在含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上培养,挑取单个菌落,接种于2 mL含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养液中,37 ,200 r/min恒温摇床振荡培养至OD600值为0.6左右。加入终浓度为2 mmol/L的IPTG,培养2 h后收取菌液。 7.3.2 ASFV p54蛋白抗原的
9、纯化 7.3.2.1 将7.3.1中收集的菌液在4 3000 r/min离心15 min,去上清,收集菌体。用PBS重悬沉淀,4 3000 r/min离心15 min,去上清。用细菌细胞蛋白裂解液重悬菌体,冰上超声破碎,4 12000 r/min离心15 min,收集上清液。 7.3.2.2 采用Ni柱亲和层析方法纯化7.3.2.1中收取的菌液超声破碎上清液, 获得表达抗原, 测定蛋白质浓度,加入抗原保护剂,分装每瓶0.5 mL,真空冻干保存。 7.3.3 ASFV p54蛋白抗原的检验及贮藏 7.3.3.1 性状 真空冻干保存的非洲猪瘟病毒p54重组蛋白呈白色固体,无臭、无味。 7.3.3.
10、2 浓度测定 复溶后蛋白质浓度应不低于250 g/mL。 7.3.3.3 纯度测定 采用SDS-PAGE对表达产物进行考马斯亮蓝染色,结果只在28 ku大小处出现条带。 7.3.3.4 特异性检验 将7.3.2.2中收取的蛋白抗原用SDS-PAGE电泳,经考马斯亮蓝染色,结果应在28 ku大小处出现诱导表达条带。采用非洲猪瘟标准阳性血清对表达产物进行免疫印迹分析,应只在28 Ku大小处出现特异性的杂交条带。 7.3.3.5 贮藏与有效期 置28 贮藏,有效期为12个月。 8 HRP 标记的单克隆抗体的制备 8.1 杂交瘤细胞 SZDB/Z131-2015 4 分泌抗非洲猪瘟病毒 p54 蛋白的
11、特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株, 由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉)保藏(细胞株保藏号:C2014212),由深圳市检验检疫科学研究院动植检研究所构建、鉴定和供应。 8.2 单克隆抗体的制备和纯化 8.2.1 采用保存的杂交瘤细胞系,制备 5106个/mL 的细胞悬液。取 10 周龄 BALB/c 雌鼠,腹腔注射液体石蜡,每只 0.5 mL,1 周后向腹腔注射 1 mL 细胞悬液。7 d10 d 后小鼠腹部明显胀大,收集腹水。 8.2.2 将腹水于 4 8000 r/min 离心 15 min,取上清液,即为含抗非洲猪瘟病毒 p54 蛋白单克隆抗体的腹水。利用 Protein G 柱
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- SZDBZ 131-2015 非洲猪瘟病毒抗体检测 阻断酶联免疫吸附法 SZDB 131 2015 非洲 猪瘟 病毒 抗体 检测 阻断 免疫 吸附
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【din****188】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【din****188】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。