NY∕T 4031-2021 动物源性食品中住肉孢子虫检测方法.pdf
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1、ICS 11.220CCS B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 40312021动物源性食品中住肉胞子虫检测方法Detection methods of Sarcocystis spp. in animal-derived foods20217275 发布 2022-06-01 实施、中华人民共和国农业农村部发布NY/T 40312021-XT. -A-刖 a本文件按照GB/T 1. 1- 2020标准化工作导则 第1部分;标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。本文件由全国
2、动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。本文件起草单位:中国农业科学院上海兽医研究所、云南大学生命科学学院。本文件主要起草人:陈兆国、米荣升、黄燕、龚海燕、张炜华、胡俊杰。INY/T 40312021动物源性食品中住肉抱子虫检测方法1范围本文件规定了动物肌肉中住肉抱子虫包囊检查和PCR检测方法的技术要求。本文件压片镜检法适用于牛、羊、猪、马等动物肌肉中住肉抱子虫的检测;PCR法适用于黄牛中寄生 的隆美尔住肉泡子虫(S.产生.F氏住肉胞子虫(S.皿或)、莱勺 hominis) ,S. buffalonis 犬住肉抱子虫(S.tenella )、白羊犬住肉 W(S. de/ioge/
3、is,s),耗牛中寄生的枯 fusiformis、人住肉抱子虫(S.),山羊中寄生的山羊 的柔嫩住肉抱子虫(S.).猪中寄生的米氏住肉抱子虫(S. 42规范性引用下列文件仅该日期对哈GB/T 6*口:适用本文件可少的3 版本(包期的引用文件, 适用本文件。WS/T术语和本文件:缩略语下列缩略dcoxl :线粒DNA:脱氧” EB:澳化乙锭, PCR:聚合酶链思PBS:磷酸盐缓冲,D基因(Pol*l sphat eTAE: Tr is-乙酸电泳缓5样品的采集、保存和运输5. 1样品的采集根据不同动物肌肉的具体情况,每头动物采集胴体一个部位或多个部位肌肉,尤其注意采集这些肌肉 中有米粒状包囊的肌肉
4、样品,记为一份肉样,其质量不少于50 g。5.2样品的保存和运输5.2.1 采集的样品,不超过24 h检测的,在2 c-8。条件下保存即可;1月以内检测的,存放温度不高 于一20 C;超过1个月检测的,存放于一80 以下冰柜,或浸泡在福尔马林溶液中。所有阳性样品,发出 检测报告30 d后方可无害化处理。5.2.2 样品应放在不透水、防泄漏的密封袋中,置于保温盒中,并加冰袋或冰块保持低温,尽快送到实验 室。所有样品应附有一份说明,内容包括样品提交人、样品采集地点(最好标明经度和纬度)、采样日期、联 系方式、动物种类、动物年龄(日龄)、动物部位、动物病史等。1NY/T 403120216检测方法6
5、.1 压片镜检法6.1.1 主要仪器设备6.1.1.1 外科手术剪。6.1.1.2 不锈钢银子。6.1.1.3 不锈钢、铝合金或塑料肉样盘,内有格子并编号。6.1.1.4 载玻片。6.1. 1.5普通生物显微镜或倒置显微镜。6.1.2 试剂6.1.2.1 甘油(生化级):市售产品。6.1.2.2 甘油透明液(见附录A中的A.1)。6.1.3 操作方法6.1.3 . 1 目检剔除肉样上附着的脂肪组织、结缔组织撕去肌膜,暴露出肌肉表面层后,在阳光下或日光灯下仔细观 察肌肉内、肌肉表面是否含有纺锤形、圆柱形、卵圆形、椭圆形、长形等形状,与肌纤维方向平行的灰白色或 乳白色包囊。6.1.3.2压片镜检取
6、目检时剪取的包囊、疑似包囊,直接用2片载玻片压片镜检。目检未见包囊的肉样,按随机采样的 要求,用剪刀顺肌纤维方向剪取肉样,再沿肌纤维方向剪成铅笔芯大小的小条(约10 mmX3 mm X 3 mm),每个部位至少4条。将剪取的肌肉放在载玻片上,每片放置4条6条。必要时,可添加适量甘 油透明液。另取一块载玻片重叠放在有肉条的载玻片上,用力挤压,使肉条压成半透明(能初步看清另一 块载玻片下面背景的字样)。把制好的压片放在低倍显微镜下(10倍X10倍),从压片一端的边沿开始检 查,直到另一端为止。6. 1.4结果判定6. 1.4. 1不同种类的住肉抱子虫包囊大小、形态差异很大,部分种类肉眼可辨,如山羊
7、的莫尔氏住肉抱子 虫(Sar wcy s出wwa/eW)和绵羊的巨住肉胞子虫(S. gigawt ea)的包囊。莫尔氏住肉抱子虫包囊呈暗白 色、卵圆形,长可达17 mm,宽可达7 mm,常见于食道;包囊内壁分枝,呈菜花状,包含13 15 Mm长 的缓殖子;有时可见2种大小的包囊:一种末端粗而圆,缓殖子大小为(11U/m(平均14.1 r m)X(3 6)Mm (平均4.5 pt m),仅在食道肌肉中出现,另一种为薄壁包囊,小而细,所含缓殖子大小为(913)*m (平均12. 2 Mm)X(24)Mm (平均2. 9 /zm),可见于膈肌和骨骼肌中。肉眼可见的巨住肉抱子虫包囊主 要存在于年龄较大
8、的老羊,食道、喉和舌头常见,横膈膜和胴体的其他部位较少出现,其包囊长度可达 1 cm,呈暗白色,圆形、椭圆形或梨形,有时类似米粒。包囊壁薄(24!1)、光滑,常被结缔组织包围。但 多数家畜、家禽寄生的住肉抱子虫种类的包裹肉眼难以觉察,如猪的住肉抱子虫包囊长仅2 mm或更小. 因此,目检法若直接在肌肉内发现住肉抱子虫大型包囊,可判为疑似,继续进行显微镜观察;未发现住肉泡 子虫大型包囊,按显微镜观察结果判定。6.1.4. 2在显微镜下,若发现住肉抱子虫包囊,呈纺锤形、圆柱形、卵圆形、椭圆形、长形等形状,包囊壁光 滑或表面有横纹、短指状突起,压迫包囊溢出有大量直径10四m20 pt m,呈圆形、椭圆
9、形或香蕉形、颜色 偏暗的缓殖子(如果虫体已经钙化,则呈黑色小团块)(见附录B),即可确定为住肉抱子虫感染。一份肌肉 样品任一部位发现有住肉抱子虫包囊.即可判定该份肉样为住肉抱子虫阳性;若各部位肌肉均未发现住肉 独子虫包囊,则判定为阴性。6. 2 PCR 法6.2.1 仪器2ny/t 403120216.2.1.1 PCR基因扩增仪。6. 2. 1.2高速台式冷冻离心机:最大转速大于15 000 r /min。6. 2. 1.3低速大容量离心机:最大转速大于3 000 r /min。6.2. 1.4 微量可调移液器:2 *L、1O *L、2O /zL、200 000 fzLo6.2.1.5核酸电
10、泳仪。6. 2. 1.6核酸电泳槽。6.2.1.7凝胶成像分析系统。6. 2.1.8组织研磨仪。6.2.1.9高压蒸汽灭菌器。水浴锅。6.2.2材料FUBL/s6.2.2.16.2. 2.26. 2. 2. 36. 2. 2. 46.2.2.56.2,2.6外科手术雪 不锈钢,烧杯;离“ :一 200Wc.I试剂6. 2. 3. 1(PBS)(见6.2.3.26. 2. 3. 36. 2.3.46. 2. 3. 56. 2. 3. 6同类6. 2. 3. 7lOXPlR产品6. 2. 3. 86.2. 3.9引物(上、下6. 2, 3.106.2. 3. 11于质6.2. 3.12 DNA上样
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