DB37∕T 3127-2018 禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范(山东省).pdf
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1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 31272018 禽波氏杆菌凝集试验和间接 ELISA 抗体 检测技术规范 Technical Guideline of Agglutination Test and Indirect ELISA for Antibody Detection of Bordetella avium 2018-02-02 发布 2018-03-02 实施 山东省质量技术监督局 发 布 DB37/T 31272018 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员
2、会归口。 本标准主要起草单位:山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。 本标准主要起草人:朱瑞良、魏凯、胡莉萍、黄河、杨萍萍、柳洪洁、刘红红、王敏。 I DB37/T 31272018 禽波氏杆菌凝集试验和间接 ELISA 抗体检测技术规范 1 范围 本规范规定了禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术的术语和定义、试剂或材料、仪器设备,利用平板凝集试验、试管凝集试验和间接酶联免疫吸附实验(iELISA)检测禽波氏杆菌抗体的方法和技术要求。 本规范适用于禽场禽波氏杆菌的流行病学调查、诊断和疫情监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件,
3、仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14925 实验动物 环境及设施 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 禽波氏杆菌 Bordetella avium, B. avium 是波氏杆菌属(The genus Bordetella)四个种中的一个新种,1984年由Kersters确认。 3.2 试管凝集试验 tube agglutination test 常用已知已定量的抗原与一系列稀释的禽的血清混合,
4、 在保温放置后观察结果, 以判定受检血清有无相应抗体及其效价。多用于半定量和定量试验。 3.3 间接酶联免疫吸附实验 indirect enzyme-linked immunosorbent assay, iELISA ELISA是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。iELISA是基于ELISA反应原理设计的,包被抗原后加入待测抗体,反应后洗板,加入酶标二抗,反应后再洗板,加入底物显色。 4 试剂或材料 4.1 禽波氏杆菌标准株 1 DB37/T 31272018 禽波氏杆菌P5株,购自中国兽医药品监察所。 4.2 禽波氏杆菌阳性血清 SPF鸡经免
5、疫禽波氏杆菌抗原三次后获得的血清,每次免疫间隔两周。 4.3 阴性血清 从SPF鸡分离的血清。 4.4 待检禽血清 采集禽的血液,于37 温箱中静置2 h,收集析出的血清。 4.5 生化试剂 灭菌0.5 %石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HCl、牛血清白蛋白(BSA)、底物反应液(具体配制方法见附录A)。 5 仪器设备 5.1 平板(玻板、白瓷板或载玻片)。 5.2 微量移液器:量程为 20 L100 L。 5.3 接种环。 5.4 试管架。 5.5 小试管(口径 8 mm10 mm)。 5.6 灭菌吸管(1 mL)。 5.7 恒温培养箱。 5.8 匀速振荡器。 5.9 96 孔
6、ELISA 酶标板。 5.10 酶标仪(波长范围 340 nm850 nm)。 6 禽波氏杆菌抗体检测平板凝集试验 6.1 用 20 L 微量移液器分别吸取三滴禽波氏杆菌 P5 株标准抗原于平板上。 6.2 再分别取禽波氏杆菌阳性抗体、阴性血清和待检禽血清各一滴加入上述抗原液中,并用接种环混合均匀,3 min5 min 观察结果。 6.3 平板凝集试验可参考图 1: 2 DB37/T 31272018 图1 平板凝集试验图示 6.4 结果判定: 6.4.1 阳性血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒, 阴性血清与阳性抗原作用后仍均匀混浊, 试验结果有效。 6.4.2 待检禽血清与阳性抗原作用后出
7、现明显凝集颗粒,则判为阳性。 6.4.3 待检禽血清与阳性抗原作用后均匀混浊,则判为阴性。 6.4.4 待检禽血清与阳性抗原作用后介于阴阳性之间,判为可疑。 7 禽波氏杆菌抗体检测试管凝集试验 7.1 被检禽血清稀释度设定 通常情况下,用1:25、1:50、1:100、1:200四个稀释度;大规模检疫时,可只用前两个稀释度。 7.2 血清的稀释及抗原的加入 7.2.1 血清的稀释 7.2.1.1 为每份血清准备小试管 5 支,第一管加入 2.3 mL 石炭酸生理盐水,第二管不加,第三、四、五管各加入 0.5 mL 石炭酸生理盐水。 7.2.1.2 用1 mL吸管吸取被检血清0.2 mL, 加入
8、第一管中, 并混合均匀, 然后用吸管吸取混合液0.5 mL,加入到第二管中,混合均匀,再吸取混合液 0.5 mL 加入到第三管,同样混匀,从中吸取 0.5 mL 加入第四管混匀,再从第四管吸取 0.5 mL 加入第五管,第五管混匀后弃去 0.5 mL。这样稀释之后,从第二管到第五管,血清稀释度分别为 1:12.5、1:25、1:50、1:100。 7.2.2 加入抗原 先用含0.5 %石炭酸生理盐水, 将抗原原液作20倍稀释, 然后从第二管起每管加入抗原稀释液0.5 mL(第一管不加,作血清蛋白凝固对照),振荡均匀。加入抗原后,第二至第五管各管混合液的容积均为1 mL,血清稀释度依次变为1:2
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