DB34∕T 3121-2018 Ⅰ群血清4型禽腺病毒核酸PCR检测技术规程(安徽省).pdf
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1、ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 31212018 群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测 技术规程 Technical Regulations of PCR Assay for Detection of Fowl Aviadenovirus Serotype 4 Nucleic Acid 文稿版次选择 2018 - 04 - 16 发布 2018 - 05 - 16 实施安徽省质量技术监督局发 布 DB34/T 31212018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由阜阳市畜牧兽医局提出。 本标准由安徽省农业标
2、准化技术委员会归口。 本标准起草单位: 阜阳市立华畜禽有限公司、 阜阳市动物疫病预防与控制中心、 阜阳市畜牧兽医局、颍东区畜牧兽医局、阜阳市动物卫生监督所。 本标准主要起草人:孟宪臣、张海涛、郭强、李东风、桑晓媛、高树朋、高永士、潘五岳、郑玉才、罗燕、刘新、薛亚梅、吴含萍、张娟娟。 DB34/T 31212018 1 群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测技术。 本标准适用于对活禽肛拭子和病死禽肝脏进行群血清 4 型禽腺病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所
3、注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 21674 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 3 缩略语 以下缩略语适用于本文件。 FadV(Fowl Aviadenovirus):群禽腺病毒。 FAdV-4(Fowl Adenovirus-4):群血清 4 型禽腺病毒。 PCR(Polymerase Chain Reaction):聚合酶链式反应。 DNA(Deoxyribonucleic Acid):脱氧核糖核酸。 ExTaq 酶: 从水生栖热菌 Thermus Aquaticus (Taq
4、) 中分离出的具有热稳定性的 DNA 聚合酶,ExTaq酶是其中的一种。 PBS(Phosphate Buffer Solution):磷酸盐缓冲液。 SPF(Specific Pathogen Free):无特定病原。 4 主要仪器 4.1 高速台式冷冻离心机 4.2 生物安全 II 级通风柜 4.3 PCR 扩增仪 4.4 核酸电泳仪 4.5 微量移液器(2 L、10 L、100 L、1000 L) 4.6 超低温冰箱 4.7 核酸凝胶成像系统 4.8 高压蒸汽灭菌锅 4.9 电热恒温鼓风干燥箱 4.10 微量振荡器 DB34/T 31212018 2 5 主要试剂 5.1 消化液(见第
5、A.1 章) 5.2 2蛋白酶 K 溶液(见第 A.2 章) 5.3 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液(见第 A.3 章) 5.4 75乙醇(见第 A.4 章) 5.5 Gold View 核酸染料 5.6 上游引物 P1:FAdV-4(10 M) 5.7 下游引物 P2:FAdV-4(10 M) 5.8 琼脂糖(分析纯) 5.9 50TAE 缓冲液(见第 A.5 章) 5.10 PBS(见第 A.6 章) 5.11 DL2000 DNA Marker(见第 A.7 章) 5.12 10Loading Buffer(见第 A.7 章) 5.13 双蒸水(符合 GB/T 6682 要求) 5.14 P
6、CR 用 ExTaq(见第 A.8 章) 5.15 10ExTaq buffer(Mg2+ plus)(见第 A.8 章) 5.16 dNTP Mixture(见第 A.8 章) 6 引物 根据 GenBank 登录的 FAdV-4 (GenBank:GU188428.1)Hexon 基因核苷酸序列,设计用于扩增FAdV-4 的 PCR 引物, FAdV-4 上游引物 P1: FAdV-4 (5-GACCGTTACAAGTTTAGCATCTCC-3) , FAdV-4下游引物 P2:FAdV-4(5-TCGCAGGAAGTCGTAGTGGA-3),扩增核酸片段大小为 951 bp。 如果制备的
7、核酸模板中有 FAdV-4,PCR 产物电泳后在 951 bp 处出现条带,即为阳性,反之即为阴性。 7 样品的采集和处理 7.1 采样工具 7.1.1 棉拭子和 1.5 mL 离心管,经 121高压灭菌 15 min,烘干。 7.1.2 剪刀、镊子和研磨器,经 160干热灭菌 2 h。 7.2 样品采集 7.2.1 活禽 取泄殖腔拭子,采集方法如下: 取泄殖腔拭子时,将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便; 将拭子一并放入盛有 1.0 mL 含双抗 PBS(高压冷却后的 PBS,无菌条件下加入青霉素、链霉素各 10000 IU/mL)的 1.5 mL 离心管中,加盖标记。 7.2.2 病死禽
8、病死禽剖检并取肝脏装入一次性塑封袋或其他灭菌容器,标记,送实验室。 DB34/T 31212018 3 7.3 样品储运 样品采集后,放入密闭的塑封袋内(一个采样点的样品,放在一个塑封袋内),于保温箱中加冰、密封,24 小时内进行样品处理。 7.4 样品处理 7.4.1 泄殖腔拭子 样品在震荡器上充分混合后,取上清液转入无菌的 1.5 mL 离心管,编号备用。 7.4.2 组织脏器 取待检样品约 2.0 g 于洁净、干热灭菌的研磨器中充分研磨,加 5 mL PBS 混匀,反复冻融 3 次后,取上清液转入无菌的 1.5 mL 离心管,编号备用。 7.5 处理后的样品存放 制备的样品在 2-8条件
9、下保存应不超过 24 h,如需长期保存应置 -70以下,并应避免反复冻融。 8 检测步骤 8.1 实验室规范 群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测的实验室规范应符合 GB 19489 的要求。 8.2 核酸提取 8.2.1 核酸提取参考 GB/T 21674 的要求。 8.2.2 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管,其中 n 为被检样品、阳性对照和阴性对照数量之和,编号。其中阳性对照样品为血清学鉴定为 FAdV-4 的病料或阳性病料接种 SPF 鸡胚收获的尿囊液,阴性对照样品为灭菌双蒸水。 8.2.3 每管加入待检样品(已研磨好的被检样品上清,阳性对照样品和阴性对照样品)100 L,加
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