DB21∕T 3120-2019 水产动物物种分子鉴定COI、16S rRNA分子标记法(辽宁省).pdf
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1、ICS 65.150 B 51 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 31202019 水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA 分子标记法 Technical specification for species molecular identification using COI and 16S rRNA of aquatic animals 2019 - 02 - 28 发布 2019 - 03 - 28 实施 辽宁省市场监督管理局 发 布 DB21/T 31202019 I 前 言 本标准依据GB/T 1.12009给出的规则制定。 本标准由大连市质量技术监督局提出。 本标准由辽
2、宁省农业农村厅归口。 本标准主要起草单位:辽宁省海洋水产科学研究院。 本标准主要起草人:高磊、赫崇波、鲍相渤、高祥刚。 附录A、B、C为资料性附录。DB21/T 31202019 1 水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA 分子标记法 1 范围 本方法规定了水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法的相关术语和定义,标记方式,试剂、仪器和设备,样品采集、保存和前处理,DNA提取和检测,序列扩增和测序,以及物种鉴定的方法。 本方法适用于水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件
3、, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 水产动物物种分子鉴定 aquatic species molecular identification 指利用分子生物学手段,对水产动物样本(尤其适用于形态学特征相近、模糊或丢失的样本)的分子标记进行分析,鉴定生物种类的过程。 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction(PCR) 用一对寡核苷酸引物、 四种脱氧核糖核苷酸 (dNTPs) 为原料, 在合适的温
4、度、 离子条件和耐热DNA聚合酶催化下,在体外人工合成特异DNA片段的过程。 3.3 DNA序列测定 DNA sequencing 测定DNA分子的核苷酸序列。 3.4 序列比对 alignment 为确定两个或多个序列之间的相似性和同源性,将他们按照一定的规律进行排列。 3.5 DB21/T 31202019 2 DNA条形码-COI 细胞色素c氧化酶亚基I(cytochrome c coxidase subunit I)。 3.6 16S rRNA 16S核糖体核糖核酸(16S ribosomal RNA)。 4 标记方式 水产动物的COI和16S rRNA的DNA序列进化速度较快,同时又
5、相对保守,可作为分子标记条形码用于物种鉴定。通过PCR技术扩增水产动物的COI和16S rRNA基因部分序列,测序后在已知数据库中进行序列比对,确定物种分类信息。本方法同时对COI和16S rRNA两种分子标记条形码进行分析,并在GenBank(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)和BOLD System(http:/www.boldsystems.org)两个数据库中比对,确保鉴定成功率和准确率。 5 试剂、仪器和设备 5.1 试剂 实验仅使用分析纯试剂,水应符合GB/T 6682一级水要求。主要包含以下内容: 无水乙醇; 95 %乙醇; TE 缓冲液(p
6、H 7.6)(100 mol/L Tris-Cl,pH 7.6;10 mmol/L EDTA,pH 8.0); Taq 酶(5 U/L); 超纯水; 10PCR 缓冲液(500 mmol/L KCl;100 mmol/L Tris-Cl,pH 8.3;15 mmol/L MgCl2); 引物(10 mol/L); dNTP 混合液(每种脱氧核糖核苷三磷酸浓度 2.5 mmol/L); 溴化乙锭(10 mg/mL); 琼脂糖; 电泳标记物(markers); 平衡酚; 氯仿/异戊醇(24:1); 10Tris 硼酸(10TBE)电泳缓冲液; 灭菌蒸馏水; 液氮; 细胞裂解液(20 mmol/L)
7、。 5.2 仪器和设备 实验用仪器和设备主要包含以下内容: 凝胶成像分析系统; PCR 仪; 低温高速离心机(4 ,12000 转); DB21/T 31202019 3 稳压稳流电泳仪; 单道可调移液器; 电子天平(0.001 g); 水浴恒温震荡器; 电泳槽; 紫外分光光度计; 遗传分析仪。 6 样品采集、保存和前处理 6.1 样品采集、保存 样本采集和后续实验应在生物安全实验室进行。选择DNA含量高、多糖等含量低的肌肉、肠道、体腔液、鱼鳍等组织进行采样,样品可通过-20冷冻、或4冰鲜等方式暂时保存。 6.2 样品前处理 将样品切成5 mm左右直径的小块或薄片, 用灭菌蒸馏水洗净, 按1:
8、10左右比例将样品放入盛有95 %乙醇的离心管中,4 保存。 7 DNA 提取和检测 7.1 DNA 提取 7.1.1 取 0.1 g 左右样品置于陶瓷研钵中,加少许液氮研碎。将粉末转入 400 L500 L 细胞裂解液离心管中,37 温浴 1 h 后转入 50 水浴 3 h,期间经常摇动。 7.1.2 反应液冷却后加 500 L 平衡酚,缓慢颠倒 10 min 混匀。12000 rpm 离心 15 min,转上层水相于新离心管中(重复此过程一次)。 7.1.3 加氯仿/异戊醇 450 L,混匀后 12000 rpm 离心 10 min。转上层水相于新离心管中,加 1/10 体积 3 mol/
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