DB37∕T 3532-2019 羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法(山东省).pdf
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1、ICS 67.100.01 X 16 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 35322019 羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法 实时荧光 PCR 法 Identification of caprine,sheep and bovine derived materials in goat or sheep milk Real-time fluorescent PCR method 2019 - 03 - 21 发布 2019 - 04 - 21 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 35322019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3
2、术语和定义 . 1 4 原理 . 1 5 试剂和材料 . 1 5.1 试剂 . 2 5.2 材料 . 2 6 仪器设备 . 2 7 检测用引物和探针 . 3 8 试验步骤 . 3 8.1 取样 . 3 8.2 DNA 提取 . 3 8.3 实时荧光 PCR 检测 . 3 9 试验数据处理 . 4 9.1 PCR 有效性判定 . 4 9.2 检测结果分析和表述 . 4 10 检测过程中防止交叉污染的措施 . 4 附 录 A (规范性附录) 实时荧光定性 PCR 引物/探针序列、反应体系和结果判定 . 5 附 录 B (资料性附录) 目的基因扩增靶标参考序列 . 7 DB37/T 35322019
3、 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。 本标准由山东省畜牧专业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:山东省农业科学院生物技术研究中心。 本标准主要起草人:胡悦、范阳阳、刘艳艳、张全芳、陈雪燕、刘国霞、陈淑娟、谷玉霞、王俊燕步迅。 DB37/T 35322019 1 羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了羊奶产品中羊、牛源性成分的实时荧光定性PCR检测方法。 本标准适用于生鲜羊奶、灭菌液态羊奶、羊奶粉等羊奶制品中羊、牛源性成分的定性检测。 本方法的检出限为0.1 %。 2 规范性引用
4、文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 羊源性 本标准提及的羊源性成分为山羊和绵羊。 3.2 实时荧光PCR real-time fluorescence PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程, 对未知模板进行定性或定量分析。 3.3 Ct值 cycle th
5、reshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 根据线粒体16SrDNA基因在不同物种间保守区设计通用引物,在可变区设计物种特异性探针,采用TaqMan实时荧光PCR技术进行扩增,根据PCR扩增反应的荧光信号及循环阈值,判定羊和牛的源性成分。 5 试剂和材料 DB37/T 35322019 2 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T 6682规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 氯化钠(NaCl)。 5.1.2 浓盐酸(HCl)。 5.1.3 三羟甲基氨基甲烷(Tris base)。 5.1.4 二水乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA2
6、H2O)。 5.1.5 十二烷基硫酸钠(SDS)。 5.1.6 磷酸盐缓冲液(PBS)。 5.1.7 异硫氰酸胍(GuSCN)。 5.1.8 硅珠(silica)。 5.1.9 蛋白酶冻干品。 5.1.10 聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)。 5.1.11 无水乙醇。 5.1.12 Chelex-100 树脂。 5.2 材料 5.2.1 生理盐水:称取 0.85 g 氯化钠加 20 mL 水溶解,转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,103.4 KPa 蒸汽压(121 )灭菌 20 min,降至室温,4 保存备用。 5.2.2 20 mg/mL 蛋白酶 K 溶液:称取
7、0.2 g 蛋白酶冻干品,转移至 10 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,分装后于-20 保存。 5.2.3 5 %的 Chelex-100:称取 5 g Chelex-100 树脂,转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度。 5.2.4 1 mol/L Tris-HCl(pH 6.4)溶液:称取 12.1 g 三羟甲基氨基甲烷置于 100 mL 烧杯中,加入80 mL 水, 用浓盐酸调节 pH 至 6.4, 转移至 100 mL 容量瓶中, 加水定容至刻度, 103.4 KPa 蒸汽压 (121 )灭菌 20 min,室温保存待用。 5.2.5 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0
8、)溶液:称取 18.61 g 二水乙二胺四乙酸二钠置于 100 mL 烧杯中,加入 80 mL 水, 用 10 %的氢氧化钠溶液, 调节 pH 至 8.0, 转移至 100 mL 容量瓶中, 加水定容至刻度, 103.4 KPa 蒸汽压(121 )灭菌 20 min,室温保存待用。 5.2.6 10 % SDS:称取 10 g 十二烷基硫酸钠溶解于 80 mL 无菌水中,转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,储存于灭菌过的容器中待用。 5.2.7 DNA 结合液:称取 60 g 异硫氰酸胍,加入 5 mL 1mol/L Tris-HCl(pH 6.4)溶液,再加入 8 mL 0.5
9、mol/L 乙二胺四乙酸二钠(pH 8.0)溶液,再加入 4 mL 聚乙二醇辛基苯基醚原液(温度 60 ),转移至 100 mL 容量瓶中,加水定容至刻度。 5.2.8 TE 缓冲液:将 0.5 mL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、0.1 mL 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠(pH 8.0) 加入到 50 mL 的容量瓶中,调节 pH 至 8.0,转移至 50 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,103.4 KPa 蒸汽压(121 )灭菌 20 min,降至室温,4 保存备用。 6 仪器设备 6.1 实时荧光定量 PCR 仪:4 通道以上。 6.2 电子分析天平:感
10、量 0.1 mg。 6.3 离心机:最大离心力不小于 13 000 g。 6.4 振荡型恒温金属浴:0 100 。 DB37/T 35322019 3 6.5 高压灭菌锅。 6.6 低温冰箱:-20 4 。 6.7 超净工作台。 6.8 微量移液器:100 L1 000 L,10 L200 L,2 L20 L,0.5 L10 L。 6.9 容量瓶:10 mL,50mL,100mL。 7 检测用引物和探针 内标引物探针序列及羊和牛的引物和特异性探针序列见附录A中表A.1。 引物探针在序列中的位置参见附录B。 8 试验步骤 8.1 取样 首先收集白细胞:取液态羊奶2 mL,或者奶粉20 mg溶于2
11、 ml无菌水中,每个样品设立2个平行样,将样品于4 、2 500 g离心30 min;弃去离心管的上层乳脂和中间层乳液,保留其底部沉淀,向底部加l mL pH 7.4灭菌的PBS缓冲液,将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5 mL的离心管中,离心力3 500 g,常温离心10 min,弃去上层液体,保留底部沉淀。 8.2 DNA 提取 8.2.1 向收集的白细胞中加入 280 L 5 %的 Chelex-100 和 20 L 20 mg/ml 蛋白酶 K,56 保温 30 min以上;高速震荡 5 s10 s,100 煮沸 8 min;高速震荡 5 s10 s,13 000 g 离心 3 min,转
12、移上清液至离心柱中,13 000 g 离心 1 min,收集上清液。 8.2.2 向收集液体中加入 20 L 硅珠悬浮液和 600 L DNA 结合液,充分混匀,65 水浴 15 min,中间反转 35 次;室温放置 5 min,中间反转 35 次;4 000 g 离心 1 min,弃上清,留管底沉淀。 8.2.3 加入 500 L 70 % 乙醇,于 8 000 g 离心 1 min,重复此步骤 2 次;加入 500 L 无水乙醇;吹打悬浮,8 000 g 离心 1 min,弃上清。 8.2.4 于 8 000 g 离心 30 s,吸走残余液体,室温干燥 10 min,使残余乙醇挥发干。 8
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