高效液相色谱测定大蒜原料及大蒜片中蒜氨酸和大蒜素的方法研究.pdf
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1、160现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testing大蒜在我国的种植历史悠久,作为食物、香料,在国内的产销量一直较高。同时,其作为具有药用价值的食材,在各种疾病的治疗中作为传统民间药物使用1,其健康益处主要与有机含硫成分有关2-3。大蒜中的有机含硫化合物主要是蒜氨酸和大蒜素 2 种活性成分,通常用来表征大蒜和大蒜相关产品的质量。由doi:10.16736/41-1434/ts.2023.18.050作者简介:李锦晶(1985),男,本科,工程师,研究方向为化学分析。通信作者:李凡(1984),男,本科,工程师,研究方向为植物与食品成分分析。高效液相色谱测定
2、大蒜原料及大蒜片中蒜氨酸和大蒜素的方法研究Method Development and Validation for Quantitation of Alliin and Allicin in Garlic Raw Materialsand Garlic slice by HPLC李锦晶,李 凡,易 渡,张沿军(康宝莱蕾硕(湖南)天然产物有限公司,湖南 长沙 410100)LI Jinjing,LI Fan,YI Du,ZHANG Yanjun(Herbalife Natsource(Hunan)Natural Products Co.,Ltd.,Changsha 410100,China)摘
3、 要:本文利用蒜氨酸的改性衍生物,建立了一种提取蒜氨酸和大蒜素的独特样品制备方法。对蒜氨酸采用酶抑制剂水溶液,邻苯二甲醛(OPA)试剂为衍生试剂,在 pH值为 9.010.0 条件下提取,获得较好的反应和稳定性。用 pH6.0 的醋酸钠缓冲液提取大蒜素,以获得更稳定的大蒜素。结果显示,5的进样温度可使蒜氨酸和大蒜素在溶液中保持 48h 的稳定。关键词:蒜氨酸;衍生化;液相色谱;同时测定Abstract:This article establishes a unique sample preparation method for extracting alliin and allicin usi
4、ng modified derivatives of allicin.Enzymatic inhibitor aqueous solution was used to extract allicin,with o-phthalaldehyde(OPA)reagent as the derivative reagent.The reaction and stability were achieved under pH 9.0-10.0 conditions.Extract allicin with sodium acetate buffer at pH 6.0 to obtain more st
5、able allicin.The results showed that a sample injection temperature of 5 canmaintain the stability of alliin and allicin in solution for 48 hours.Keywords:alliin;derivatization;liquid chromatography;simultaneous determination中图分类号:TS207.2Analysis and Testing161XIANDAISHIPIN现代食品分析检测于蒜氨酸酶的存在,蒜氨酸是相当不稳定
6、的,可以迅速转化为大蒜素;大蒜素性质极不稳定,容易分解,不能长期保存。2 种活性成分的极性以及稳定性差异较大,导致准确测定大蒜及制品中的蒜氨酸和大蒜素含量的方式也差异较大。其中,蒜氨酸通常用液相色谱测定4-5;大蒜素有用气质联用仪6-7进行测定,但更多采用分光光度法8-9或者反相色谱10-11测定。因此,建立一种同时测定 2 种物质的方法,可以极大提高分析效率。在本研究中,我们开发了一种将蒜氨酸标准品转化生成大蒜素的方法,并建立了一种控制其转化的方法。测定方法的关键在于防止蒜氨酸转化为大蒜素,并在样品制备和分析中,同时稳定蒜氨酸和大蒜素。本研究采用改进的柱前衍生的样品制备方法,不仅可以减少传统
7、提取方法中常见的干扰,而且可以同时测定蒜氨酸和大蒜素。1材料与方法1.1 材料蒜氨酸标准品,USP,目录#1012950;乙腈,HPLC 级;乙酸铵,ACS 级;三水合醋酸钠,ACS;邻苯二甲醛(OPA)试剂,安捷伦#5061-3335(打开后可在冰箱中保存不超过 2 周);十水四硼酸钠,GR 级;半盐酸羧甲氧基胺,ACS 级。1.2 仪器Waters 2695 液相色谱仪,包括泵、脱气器、自动进样器、温度控制模块和 PDA 检测器;分析天平;旋涡混合器;研磨机;超声发生器;振荡器;离心机。1.3 溶剂准备蒜氨酸酶抑制剂溶液(1 mgmL-1):100 mg半盐酸羧甲氧基胺到 100 mL 纯
8、净水中。硼酸缓冲溶液(pH 9.0):将 1.9 g 十水四硼酸钠溶解在约 100 mL的纯净水中,用 0.2 molL-1硼酸调整 pH 值为 9.0。1.4 试验方法1.4.1 蒜氨酸测试样品溶液的制备称取 100 1 000 mg(精确到 0.1 mg)之间的粉末样品装入 35 mL 螺旋盖试管中,加入蒜氨酸酶抑制剂溶液(1 mgmL-1)20 mL,涡旋 30 s。超声 15 min,每隔 5 min 手动摇 5 s。用 0.2 m 针式过滤器过滤,丢弃前几滴滤液,收集约 5 mL 样品至一个小烧杯中。1.4.2 衍生化程序在小瓶中加入硼酸缓冲液 50 L,样品液 10 L,涡旋 10
9、15 s,再加入 OPA 试剂 10 L,旋涡 1015 s,等待 2 min 左右加入纯水 130 L,将此溶液放入HPLC 进样瓶用于分析。1.4.3 大蒜素测试样品溶液的制备称取 1001 000 mg(精确到 0.1 mg)之间的粉末样品装入 35 mL 螺旋盖试管中,加入 20 mL 醋酸钠缓冲液,涡旋 30 s 左右。超声 15 min,每隔 5 min 手动摇动 5 s。静置 10 min 后,加入半盐酸羧甲氧基胺 约20 mg,涡旋 30 s。用 0.2 m 针式过滤器过滤,丢弃前几滴滤液,放入 HPLC 进样瓶用于分析。1.5 测定蒜氨酸及大蒜素的色谱条件色谱柱:Agilen
10、t ZORBAX Eclipse AAA,1504.6 mm;检测波长:254 nm、520 nm;流动相A:20 mmol 乙酸铵;流动相 B:乙腈/水=90/10(体积比);梯度洗脱程序见表 1;样品温度:5;流速:1 mLmin-1;进样体积:20 L(如表 1)。表1梯度洗脱程序表时间(min)流速(mLmin-1)A(%)B(%)01.00955301.007525451.001090551.001090561.00955601.009551.6 标准溶液准备1.6.1 蒜氨酸标准原液精确称量约 10 mg(精确到 0.01 mg)蒜氨酸参考标准倒入 10 mL 容量瓶中,加入约 6
11、 mL 水,将溶液超声处理 10 min,用水稀释至刻度,摇匀备用。1.6.2 蒜氨酸工作标准溶液工作标准溶液 1:将 1 mL 蒜氨酸原液标准溶液移至 10 mL 容量瓶中,用水稀释至刻度并摇匀。工作标准溶液 2:将 2.5 mL 蒜氨酸原液标准溶液移到 5 mL 容量瓶中,用水稀释至刻度并摇匀。工作标准溶液 3:蒜氨酸原液标准溶液作为工作标准溶液 3。每次工作溶液使用时,用 0.2 注射器过滤器过滤储存溶液,并遵循衍生化程序进行衍生化。162现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testing1.6.3大蒜素工作标准溶液取 1.0 m L 蒜 氨 酸 工 作
12、 标 准 溶 液 2(约0.5 0 m g m L-1),加 入 1 0 0 L 粗 蒜 氨 酸酶 溶液,室温静置 10 min。用水稀释,用 0.2 注射器过滤器过滤。蒜氨酸工作标准溶液2 浓度(mgmL-1)162.26 354.425其中,162.26:大蒜素的分子量;354.42:蒜氨酸分子量的 2 倍。2结果与分析2.1衍生化溶液 pH 值对蒜氨酸产率和稳定性的影响如图 1 所示,蒜氨酸面积随着缓冲液的 pH 值增加而增加。当缓冲液的 pH 值在 4.0 5.5 之间时,蒜氨酸的衍生转化效率较低;当缓冲液 pH 值为 5.510.0时,蒜氨酸衍生化反应效率转化较高且没有明显变化。伴随
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