高糖诱导小鼠脑缺血后出血转化的研究.pdf
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1、基础研究高糖诱导小鼠脑缺血后出血转化的研究李友维,张涵,王思昊,刘宇婧,吴园,桂玉然,周梅,柳威摘要:目的 探讨稳定的高糖诱导小鼠脑缺血后出血转化模型的实验条件。方法 采用线栓法制备小鼠大脑中动脉闭塞模型,将小鼠按照葡萄糖浓度(1 0%,2 0%,3 0%,4 0%,5 0%)与缺血时间(3 0m i n,1、2、3h)进行组合,每个浓度4个时间点,共分为2 0组合,每组6只。术前1 5m i n腹腔注射不同浓度葡萄糖,分别在脑缺血术后3 0m i n,1、2、3h拔出线栓恢复再灌注,诱导小鼠脑缺血后出血转化模型。以术后2 4h内死亡率以及术后7d内脑出血大体观察,脑皮质和白质出血量,出血发生
2、率及死亡率为指标。结果 大体观察显示,随着缺血时间延长或葡萄糖浓度升高,脑组织出血发生率呈逐渐上升趋势。苏木精-伊红染色镜下观察显示,大部分模型组合小鼠随着缺血时间延长或葡萄糖浓度升高,大脑白质及皮质内出血量呈逐渐上升趋势。术后7d内,葡萄糖浓度升高或缺血时间延长均增加模型小鼠出血发生率,差异有统计学意义(F=1 5.2 8 2,F=6.6 3 2,P0.0 1)。术后2 4h和术后7d内,葡萄糖浓度升高或缺血时间延长均显著增加模型小鼠死亡率,差异有统计学意义(P0.0 5,P0.0 1)。结论 当葡萄糖浓度为3 0%,缺血时间为3 0m i n时,高糖诱导可制备死亡率低,出血转化发生率高的脑
3、梗死后出血转化模型。关键词:脑缺血;模型,动物;脑出血;葡萄糖浓度H i g hg l u c o s e-i n d u c e dh e m o r r h a g i c t r a n s f o r m a t i o n i nm i c ea f t e r c e r e b r a l i s c h e m i aL iY o u w e i,Z h a n gH a n,W a n gS i h a o,L i uY u j i n g,WuY u a n,G u iY u r a n,Z h o uM e i,L i uW e i(S c h o o l o fM e
4、d i c i n e,J i a n g h a nU n i v e r s i t y,W u h a n4 3 0 0 5 6,H u b e iP r o v i n c e,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T oe x p l o r et h es t a b l ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n so fh i g hg l u c o s e-i n d u c e dh e m-o r r h a g e t r a n s f o r m a t i o nm o
5、d e l i nm i c e a f t e r c e r e b r a l i s c h e m i a.M e t h o d s T h em o u s em o d e l o fm i d-d l ec e r e b r a l a r t e r yo c c l u s i o nw a se s t a b l i s h e db yt h r e a do c c l u s i o n.D i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fg l u-c o s e(1 0%,2 0%,3 0%,4 0%,5 0%)w
6、 e r e i n j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y1 5m i nb e f o r e c e r e b r a l i s c h e m i-a.I n3 0 m i na n d1,2a n d3ha f t e rc e r e b r a l i s c h e m i a,t h es u t u r ew a sr e m o v e dt or e s t o r eb l o o dr e p e r f u s i o nt o i n d u c et h em o d e lo fh e m o r r
7、h a g et r a n s f o r m a t i o n.T h u s,t h em i c ew e r ed i v i d e di n t o2 0g r o u p sw i t h6m i c e e a c hg r o u p.D e a t hw i t h i n2 4ha f t e r o p e r a t i o n,g r o s s v i e wo f c e r e b r a l h e m o r-r h a g e7da f t e ro p e r a t i o n,a m o u n to fh e m o r r h a g e
8、i nc e r e b r a l c o r t e xa n dw h i t em a t t e r,i n c i d e n c eo fh e m o r r h a g ea n dm o r t a l i t yw e r eu s e d t oe v a l u a t e.R e s u l t s G r o s so b s e r v a t i o ns h o w e d t h a t t h e i n c i-d e n c eo f c e r e b r a l h e m o r r h a g ew a s i n c r e a s e d
9、g r a d u a l l yw i t h t h ed u r a t i o no f i s c h e m i a t i m eo r i n c r e-m e n to fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n.HEs t a i n i n gd i s p l a y e dt h a tt h eh e m o r r h a g ea m o u n t i nt h ew h i t em a t t e ra n dc o r t e xw a se l e v a t e dw i t ht h ep r o l o n
10、g a t i o no f i s c h e m i at i m eo r t h e i n c r e a s eo fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n i nm o s tm o d e lm i c e.W i t h i n7da f t e ro p e r a t i o n,i n c r e a s eo fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no rp r o l o n g a t i o no f i s c h e m i a t i m e i n c r e a s e dt
11、h e i n c i d e n c eo fh e m o r r h a g e i nm o d e lm i c e(F=1 5.2 8 2,F=6.6 3 2,P0.0 1).E l e v a t e dg l u c o s el e v e la n dp r o l o n g e di s c h e m i cd u r a t i o ns i g n i f i c a n t l yr a i s e dt h em o r t a l i t yr a t e s i n2 4ha n d7dp o s t-o p e r a t i v e l y(P0.0
12、5,P0.0 1).C o n c l u s i o n M o u s em o d-e lo fh e m o r r h a g et r a n s f o r m a t i o nc a nb ei n d u c e d w i t h3 0%g l u c o s ec o n c e n t r a t i o na n d3 0 m i ni s c h e m i cd u r a t i o n,f o rh i g h e r i n c i d e n c eo f t r a n s f o r m a t i o na n d l o w m o r t a
13、l i t y.K e yw o r d s:b r a i n i s c h e m i a;m o d e l s,a n i m a l;c e r e b r a lh e m o r r h a g e;c o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s eD O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-0 1 2 6.2 0 2 3.0 8.0 1 9基金项目:湖北省自然科学基金(2 0 2 2 C F C 0 5 7)作者单位:4 3 0 0 5 6武汉,江汉大学医学部(李友维,张涵,王思昊,刘宇婧,吴园);江汉大学脑血管
14、病研究所(桂玉然,周梅,柳威)通信作者:柳威,E m a i l:l i u w e i j h u n.e d u.c n268中华老年心脑血管病杂志2 0 2 3年8月 第2 5卷 第8期 C h i nJG e r i a t rH e a r tB r a i nV e s s e lD i s,A u g2 0 2 3,V o l 2 5,N o.8 脑卒中是我国居民的第一位死因,其中缺血性脑卒中占8 0%,具有发病率、致残率、病死率、复发率高的特点1。虽然溶栓或介入治疗能有效减轻脑梗死患者缺血缺氧性损伤,但再灌注后血管破坏会进一步加重损伤。再灌注后出血转化严重影响溶栓、介入治疗的有
15、效性评估2。目前,脑梗死后出血转化的研究较少,究其原因,主要与动物模型制作难度高、早期死亡率高、远期存活率低有关。有研究采用线栓法制备大鼠出血转化模型时,随着缺血时间延长,缺血组织出血量评分及血红蛋白含量呈逐渐上升趋势3。高血糖是诱发脑梗死后出血转化的重要因素4-5。除此之外,大面积脑梗死、高血压、低血脂、侧支循环不良等因素均可能增加出血转化发生率6。本研究前期发现,术前腹腔注射3 0%葡萄糖后,再灌注期间高血糖能有效诱发脑梗死后出血转化。本研究在线栓法小鼠脑梗死模型基础上,探讨缺血时间、血糖浓度、出血转化率和动物死亡率的关联,以期筛选出制作脑梗死后出血转化模型的最佳条件,为相关研究提供实验基
16、础。1 材料与方法1.1 实验动物 选择雄性S P F级C 5 7 B L/6 J小鼠1 2 0只,5 66 2日龄,体质量2 22 6g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司S C X K(京)2 0 2 1-0 0 0 6,每笼不超过5只,室温2 0 2 6,湿度4 0%7 0%,光照以1 2h/1 2h昼夜明暗交替,自由摄入饲料及饮用水,适应性喂养7d。1.2 小鼠大脑中动脉闭塞模型制备 采用异氟烷(深圳瑞沃德有限公司)吸入麻醉后,术中1.5%异氟烷维持麻醉,小鼠仰卧位固定,沿颈部中线切开皮肤,暴露并游离左侧颈总动脉(C C A)、依次分离颈外动脉(E C A)、颈内动脉(I C A)。
17、游离并离断E C A后,临时阻断C C A和I C A,从E C A距C C A分叉5mm处插入大脑中动脉闭塞单丝尼龙线(深圳瑞沃德有限公司),再经过C C A进入大脑中动脉,插入深度距C C A分叉(9.50.5)mm,感受到阻力后停止。插线前1 5m i n腹腔注射不同浓度葡萄糖溶液,不同缺血时间后,轻轻拔出尼龙线恢复血液灌注,并缝合手术切口。术中体温维持在(3 70.5)。实验过程中尽量规范手术操作,减轻动物痛苦。将小鼠按照葡萄糖浓度(1 0%,2 0%,3 0%,4 0%,5 0%)与缺血时间(3 0m i n,1、2、3h)进行组合,每个浓度4个时间点,共分为2 0组合,每组6只,满
18、足研究要求共1 1 3只。1 0%和5 0%葡萄糖溶液按照比例配成不同浓度葡萄糖溶液,小鼠在大脑中动脉闭塞术前1 5m i n腹腔注射不同浓度的葡萄糖溶液。1.3 组织病理学检测 所有小鼠在濒死时或造模成功7d,采用异氟烷深度麻醉后处死,4%多聚甲醛灌流后取出脑组织,去除嗅球,往后37mm处冠状切片。肉眼观察脑组织表面和切片出血转化情况,经固定后采用梯度乙醇脱水,石蜡包埋切片,进行苏木精-伊红染色,镜下观察确认出血转化。小鼠全部取材完成后,统计造模成功小鼠数量,造模成功后小鼠死亡数量,通过脑组织横剖面观察并统计小鼠脑组织发生出血量以及严重程度。出血发生率(%)=每组小鼠脑组织发生出血量/每组小
19、鼠造模成功数量1 0 0%;死亡率(%)=每组造模成功后小鼠死亡数量/造模成功后小鼠总数量1 0 0%。1.4 统计学方法 采用S P S S2 7.0软件,计量资料以xs表示,用独立样本t检验,计数资料以百分率表示,用2检验,P0.0 5为差异有统计学意义。2 结 果2.1 不同组合小鼠脑组织出血程度 小鼠处死取材后对脑组织出血情况进行大体观察,除1 0%葡萄糖+3 0m i n缺血时间外,其余模型组合均发生不同程度出血转化,且随着缺血时间延长或葡萄糖浓度升高,脑组织出血程度呈逐渐上升趋势(图1)。图1 不同组合小鼠脑组织大体观察出血程度2.2 不同模型组合小鼠脑组织病理学检测 苏木精-伊红
20、染色镜下观察显示,除1 0%葡萄糖+3 0m i n缺血时间、1 0%葡萄糖+1h缺血时间、2 0%葡萄糖+3 0m i n缺血时间外,其余模型组合小鼠均有大脑皮质内出血,且随着缺血时间延长或葡萄糖浓度升高,脑皮质内出血量呈逐渐上升趋势(图2);除1 0%葡萄糖+3 0m i n缺血时间外,其余模型组合小鼠均有大脑白质内出血,且随着缺血时间延长或葡萄糖浓度升高,脑白质内出血量呈逐渐上升趋势(图3)。2.3 不同模型组合小鼠出血发生率比较 术后7d内,1 0%葡萄糖+3 0m i n缺血时间小鼠出血发生率为0,其余模型组合小鼠均有不同数量发生出血转化(表1)。368中华老年心脑血管病杂志2 0
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