干酪乳杆菌Zhang分类学地位及潜在益生相关基因分析.pdf
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1、干酪乳杆菌 Zhang 分类学地位及潜在益生相关基因分析孙佳琦1袁2袁3袁李伟程1袁2袁3袁钟智1袁2袁3袁张和平1袁2袁3*渊1内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室呼和浩特 0100182内蒙古农业大学农业农村部奶制品加工重点实验室呼和浩特 0100183内蒙古农业大学内蒙古乳业生物技术与工程重点实验室呼和浩特 010018冤摘要干酪乳杆菌 Zhang 是本研究团队筛选出的具有优良特性的益生乳酸菌菌株遥 传统方法难以区分干酪乳杆菌及其近缘物种遥 因最近乳杆菌的系统分类进行了更新袁故导致 Zhang 的分类地位需重新确认遥 本研究利用比较基因组学方法分析Zhang 的分类学地位尧耐
2、药基因尧致病性基因和环境抗性基因特征袁探究该菌株基因组上携带的细菌素基因簇和潜在益生基因遥 比较基因组学结果显示 Zhang 与副干酪乳酪杆菌模式菌株 ATCC 25302T的平均核苷酸一致性值是 98.49%袁通过分类学数据库比对和系统发育分析确认 Zhang 的分类学地位为副干酪乳酪杆菌遥 Zhang 的基因组不含有耐药基因尧致病性基因和环境抗性基因遥 在其基因组上注释到核心肽尧LanT 转运和引导切割及免疫或运输功能等 Carnocin 细菌素基因簇遥 此外袁Zhang 的基因组编码了谷胱甘肽合成尧核黄素合成尧黏附因子和分泌胞外多糖等潜在益生基因遥 本研究更新了 Zhang 的分类学地位
3、为副干酪乳酪杆菌袁揭示其不含有耐药基因尧致病性基因及环境抗性基因袁并注释到多个潜在益生基因袁为该菌株进一步开发及产业化提供了数据参考遥关键词副干酪乳酪杆菌曰 比较基因组学曰 细菌素基因簇曰 潜在益生基因文章编号1009-7848渊2023冤08-0014-10DOI院 10.16429/j.1009-7848.2023.08.002副干酪乳酪杆菌作为乳杆菌科中具应用价值的菌种袁 是干酪乳酪杆菌和鼠李糖乳酪杆菌的近缘物种遥 副干酪乳酪杆菌是国家卫生健康委员会发布的可用于食品的菌种之一袁 其常用来制备益生菌和发酵乳制品制剂1遥 然而袁副干酪乳酪杆菌的系统命名和分类一直存在争议袁 特别是随着分类学技
4、术的进步袁该物种的模式株尧系统分类和命名几经变迁2遥 1989 年 Collins 等3通过 DNA-DNA杂交分析发现干酪乳杆菌渊Lactobacillus casei冤中存在大量与模式菌株 ATCC 393T同源性较低而菌株间同源性较高的菌株袁 因此建议干酪乳杆菌阿拉伯糖亚种 渊Lactobacillus casei subsp.alacto鄄sus冤尧干酪乳杆菌假植物亚种渊Lactobacillus caseisubsp.pseudoplantarum冤尧 干酪乳杆菌坚韧亚种渊Lactobacillus casei subsp.tolerans冤 以及大部分的干酪乳杆菌干酪亚种 渊Lac
5、tobacillus casei sub鄄sp.casei冤划分为一个新的独立菌种即副干酪乳杆菌渊Lactobacillus paracasei冤遥 2020 年副干酪乳杆菌 更 名 为 副 干 酪 乳 酪 杆 菌 渊Lacticaseibacillusparacasei冤袁其模式菌株为 ATCC 25302T袁并保留了副干酪乳酪杆菌副干酪亚种渊L.paracasei sub鄄sp.paracasei冤 和副干酪乳酪杆菌坚韧亚种渊L.paracasei subsp.tolerans冤2 个亚种4-5遥干酪乳杆菌 Zhang渊Zhang冤是本研究团队于2001 年从内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗大草原传
6、统发酵酸马奶中分离得到的 1 株益生菌6-7袁其具有较强耐人工胃液8尧胆盐消化9尧免疫调节10尧抗氧化11等益生功能遥2008 年袁本研究团队经生理生化鉴定和 16S rDNA 序列分析将 Zhang 的分类学地位鉴定为干酪乳杆菌12-13遥干酪乳杆菌与其近缘物种间的亲缘关系错综复杂袁 基于传统的分类学方法和 16S rDNA 序列很难从种水平上进行区分14遥本研究团队于 2010 年完成了 Zhang 全基因组测序袁 其是我国第 1 株完成全基因组测序的乳酸菌菌株袁 经进一步比较基因组学分析确认其的分类学地位为副干酪乳酪杆菌15遥 由于副干酪乳酪杆菌分类学地位的变迁和更新袁Zhang 的分类
7、学地位需进一步确认遥 此外袁目前尚无关于该菌株耐药基因尧致病性基因和环境抗性基因的研究袁限制了其进一步开发和应用遥收稿日期院 2023-05-03基金项目院 国家自然科学基金项目渊U22A20540冤第一作者院 孙佳琦袁女袁硕士生通信作者院 张和平E-mail院 hepingddvip.sina灾燥造援 23 晕燥援 8Aug援 圆 园 2 3允燥怎则灶葬造 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠中 国 食 品 学 报第 23 卷第 8 期圆 园 2 3 年 8 月第 23 卷 第 8 期叶益生菌的科学共识曳渊2020 版冤中建议
8、针对益生菌菌株的安全性评估袁 应基于全基因组测序生物信息分析袁 阐述待评价益生菌菌株所携带的耐药基因尧致病性基因和环境抗性基因的特征16遥基于此袁本研究利用比较基因组学方法解析 Zhang的分类学地位和遗传背景袁 评估 Zhang 的耐药基因尧致病性基因和环境抗性基因特征袁揭示其基因组上携带的细菌素基因簇及潜在益生基因袁 旨在为菌株进一步开发及产业化提供数据参考遥1材料与方法1.1基因组序列下载截至 2023 年 3 月 9 日袁 采用 ncbi-genome-download 软件将 NCBI 渊National Coalition Build鄄ing Institute袁 https院/w
9、ww.ncbi.nlm.nih.gov/冤Ref鄄seq 数据库中 318 株副干酪乳酪杆菌基因组完成图全部下载完成遥本研究团队前期已完成 Zhang 连续传代过程遗传稳定性的研究渊已接收袁未见刊冤袁对第 0袁25袁50袁75袁100 代渊每代 3 组平行冤共 15 株菌进行了基因组测序和组装工作遥1.2比较基因组分析1.2.1基因组信息统计采用李伟程17的方法袁统计所有副干酪乳酪杆菌的基因组大小尧GC 含量以及蛋白质编码区渊Coding sequence袁 CDS冤遥1.2.2分类学地位分析和平均核苷酸一致性计算本研究使用 blastall 软件18将 Zhang 与 GTDB 数据库渊ht
10、tp院/gtdbecogenomic.org/冤进行比对袁e 值小于 e伊10-10遥 使用 fastANI 软件19计算 335 株副干酪乳酪杆菌的平均核苷酸一致性 渊Average nu鄄cleotide identity袁 ANI冤值袁比对片段长度设置为1 000遥1.2.3核心基因系统发育树使用 prokka 软件对菌株进行注释袁通过 Roary20软件分析得到的核心基因序列袁采用 TreeBeST21软件渊http院/ 基于邻接法 渊Neigh鄄bor-joining袁 NJ冤进行系统发育树构建袁自举值为1 000遥 通过 iTol 在线软件渊https院/itol.embl.de/
11、冤进行系统发育树可视化遥1.2.4单核苷酸多态性渊SNP冤系统发育树的构建本研究以副干酪乳酪杆菌 ATCC 334 的全基因组完成图序列渊GCF_000014525.1冤作为参考基因组袁使用 Snippy 软件22渊V4.6.0冤中 snippy-multi 组件计算副干酪乳酪杆菌群体的核心 SNP 渊Core-SNP冤遥采用 TreeBeST21软件渊http院/www.mybiosoft鄄 自举值为 200遥 在 iTol 在线软件渊https院/itol.embl.de/冤中进行系统发育树可视化遥1.2.5耐药基因尧 致病性基因和环境抗性基因注释将 Zhang 基因组序列分别上传至在线注
12、释CARD 数 据 库 渊http院/card.mcmaster.ca/袁 采 用RGI5.1.0 软件中的 Perfect 和 Strict 算法为筛选标准冤尧ResFinder 数据库渊https院/cge.food.dtu.dk/ser鄄vices/ResFinder-4.1/冤袁序列相似性90%袁序列覆盖度60%尧VFDB 数据库 渊Virulence Factors ofPathogenicBacteria袁http院/ Vir鄄ulenceFinder 数 据 库 渊https院/cge.food.dtu.dk/ser鄄vices/Virulence Finder/冤袁序列相似性9
13、0%袁序列覆盖度60%进行注释耐药基因尧致病性基因和环境抗性基因遥1.2.6共线性分析以副干酪乳酪杆菌 ATCC334 为参考序列袁使用 Mauve 软件23分析 ATCC334T尧Zhang 和 PC-01 之间的共线性关系遥1.2.7细菌素基因簇分析利用 BAGEL4 在线数据 库渊http院/bagel4.molgenrug.nl/index.php冤袁 对Zhang 中核糖体合成尧翻译后修饰肽和细菌素产生基因簇进行注释24遥1.2.8潜在益生基因分析参照刘旭等25和吴琼等26的方法利用 Prokka 软件对菌株基因组进行基因预测后袁挖掘菌株潜在益生基因遥2结果与讨论2.1基因组特征本研
14、究团队前期已完成 Zhang 的基因组测序和组装袁发现 Zhang 包含 1 条染色体和 1 个质粒袁其基因组大小为 2.90 Mb袁GC 含量为 46.43%袁其中染色体大小为 2.73 Mb袁GC 含量为 46.51%曰质粒大小为 36.08 kb袁GC 含量为 39.65%袁 共包含了2 694 个蛋白质编码区15遥本研究团队前期完成的副干酪乳酪杆菌 PC-干酪乳杆菌 Zhang 分类学地位及潜在益生相关基因分析15中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期图 1333 株副干酪乳酪杆菌基因组序列的 ANI 值Fig.1ANI value of the genome sequences
15、of 333 strains of L.paracasei01 的基因组测及序组装27袁发现基因组仅有 1 条染色体组成遥其基因组大小为 2.82 Mb袁GC 含量为46.64%袁包含了 2 738 个蛋白质编码区遥 王静等28研究发现副干酪乳酪杆菌基因组大小为 2.383.29 Mb袁 平均为 2.98 Mb曰GC 含量为 46.00%46.60%袁平均为 46.33%曰平均包含了 2 777 个蛋白质编码区遥 本研究发现副干酪乳酪杆菌基因组大小为渊2.87依0.15冤Mb曰GC 含量为渊46.31依0.25冤%曰包含了 2 875.8依164.8 个蛋白质编码区遥2.2分类学地位确定GTD
16、B 数据库使用相对进化差异来描述高等级的分类单元并划分物种集群尧限定分类单元袁因此该数据库可以实现基因组在物种水平的分类29遥 本研究使用 GTDB 数据库对 Zhang 的分类学地位进行确定袁结果显示其为副干酪乳酪杆菌遥ANI 通过在全基因组学水平进行基因组的同源序列比对从而鉴定菌株的亲缘关系30遥 比较基因组学中袁一般将 ANI 值大于 95%视为同一物种31遥结果显示近缘物种干酪乳酪杆菌 ATCC 393T尧鼠李糖乳酪杆菌 DSM 20021T与 334 株副干酪乳酪杆菌的 ANI 值小于 95%袁333 株副干酪乳酪杆菌之间 ANI 值均大于 95%袁 表明其为同一物种遥Zhang 与
17、 模 式 菌 株 ATCC 25302T的 ANI 值 是98.49%袁大于 95%袁说明 Zhang 与副干酪乳酪杆菌ATCC 25302T为同一物种遥 上述结果表明袁Zhang的分类学地位应为副干酪乳酪杆菌渊Lacticas鄄eibacillus paracasei冤遥2.3系统发育分析系统发育树可直观反映菌株间群体结构和遗传进化关系32遥 为了分析 Zhang 与公共数据库中318 株副干酪乳酪杆菌的系统发育关系袁 本研究以近缘物种干酪乳酪杆菌 ATCC 393T和鼠李糖乳酪杆菌 DSM 20021T作为外群袁基于 59 个核心基因的核酸序列袁通过邻接法构建系统发育树遥由图 2a 可知袁
18、 核心基因系统发育树分为 3 个大分支袁分别为作为外群的干酪乳酪杆菌 ATCC 393T尧鼠李糖乳酪杆菌 DSM 20021T以及 333 株副干酪乳酪杆菌袁 表明不同物种在核心基因系统发育树上具有较大差异遥 此外袁Zhang 与模式菌株副干酪乳酪杆菌 ATCC 25302T聚集在同一大分支中袁该结果支持 Zhang 为副干酪乳酪杆菌遥Zhang 原始菌株与其第 0袁25袁50袁75袁100 代菌株聚集在同一小分支袁与副干酪乳酪杆菌 SCB0563 的遗传距离较近遥 对干酪乳酪杆菌 ATCC 393T尧鼠李糖乳酪杆菌DSM 20021T尧副干酪乳酪杆菌 ATCC 25302T和副干酪乳酪杆菌坚
19、韧亚种 DSM 20258T以及 Zhang的 335 个核心基因的核酸序列袁 使用最大似然法渊Maximum likelihood袁 ML冤构建系统发育树遥由图2b 可知袁副干酪乳酪杆菌 ATCC 25302T尧副干酪乳酪杆菌坚韧亚种 DSM 20258T和 Zhang 聚集在同一进化枝上袁 再次验证了 Zhang 的分类学地位为副干酪乳酪杆菌遥然而袁由于不同物种之间差异较大袁 因此无法判断 Zhang 亚种水平的分类学地位遥 本研究团队前期通过比较 16S rRNA尧看家基因和核心基因的系统发育树袁 发现副干酪乳酪杆分类Zhang界门纲目科属种细菌界渊Bacteria冤硬壁菌门渊Firmi
20、cutes冤芽孢菌纲渊Bacilli冤乳杆菌目渊Lactobacillales冤乳杆菌科渊Lactobacillaceae冤乳酪杆菌属渊Lacticaseibacillus冤副干酪乳酪杆菌渊Lacticaseibacillus paracasei冤表 1Zhang 的 GTDB 数据库比对结果Table 1The alignment results of the GTDB databaseof Zhang16第 23 卷 第 8 期渊a冤渊b冤渊c冤渊d冤注院a 图和 b 图为基于核心基因构建的系统发育树袁c 图和 d 图为基于 SNP 构建的系统发育树遥图 2副干酪乳酪杆菌系统发育树Fig.
21、2Phylogenetic tree of Lactobacillus paracasei菌与亚种干酪乳酪杆菌 ATCC 393T尧 鼠李糖乳酪杆菌 DSM 20021T遗传差异较大袁 基于核心基因构建的系统发育树可以较好的区分干酪乳酪杆菌的近缘种14遥由于外群菌株与 333 株副干酪乳酪杆菌之间的遗传距离较远袁 故进一步基于以副干酪乳酪杆菌 ATCC 334 的全基因组完成图序列作为参考基因组进行 Core-SNP 分析袁 并使用 NJ 法构建系统发育树遥结果如图 2c 所示袁SNP 系统发育树分为 3个大分支袁Zhang 原始菌株与其第 0袁25袁50袁75袁100 代菌株聚集在分支 B
22、的同一小分支袁 其相互之间略有差异袁且与副干酪乳酪杆菌 SCB0563 的遗传距离较近遥 以副干酪乳酪杆菌 ATCC 334 的全基因组完成图序列作为参考基因组袁 选取各分支选取代表菌株进行 Core-SNP 分析袁 并使用 ML法构建系统发育树袁结果如图 2d 所示遥Zhang 的分类学地位为副干酪乳酪杆菌袁 然而基于核心基因和 Core-SNP 都无法在副干酪乳酪杆菌的亚种水平上对其进行区分遥 本研究团队前期发现不同代数 15 株菌所识别到的 SNP 位点均小于 21 个袁表明干酪乳杆菌 Zhang 在 MRS 液体培养基中连续传代过程中有较好的遗传稳定性 渊已接收袁 未见刊冤遥Fonta
23、na 等33研究发现副干酪乳酪杆菌群体在系统发育树中大致可划分为 4 个分支袁 与本研究系统发育树聚类结果一致遥 综上所述袁通过 ANI尧GTDB 数据库注释尧 基于核心基因的系统发育分析和基于 Core-SNP 的系统发育分析结果一致袁表明 Zhang 的分类学地位应为副干酪乳酪杆菌遥2.4共线性分析共线性可通过对同一物种不同个体基因组间同源序列及其排列顺序一致性的检测袁 来探究基因组间的相关性34遥 共线性分析结果显示袁Zhang与 ATCC 334 基因组共线性良好遥 然而袁Zhang 在其基因组 328.49 kb 位置处存在其 49.37 kb 处的特有片段袁在 Zhang 基因组
24、392.52 kb 处存在 PC-01 没有的片段袁而 ATCC 334 存在此片段遥 Zhang在其基因组 1.81 Mb 位置处存在 19.55 Kb 的特有片段袁包含酪氨酸蛋白激酶渊yveL冤和荚膜多糖生物合成蛋白质渊ywqC冤等基因遥 Zhang 基因组在 511.30 kb 处长度为 311.29 kb 的片段在 PC-01干酪乳杆菌 Zhang 分类学地位及潜在益生相关基因分析17中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期图 3副干酪乳杆菌基因组多序列比对Fig.3Multiple sequence alignment of the L.paracasei genomic的基因组
25、中发生了基因组易位遥 以上结果表明袁Zhang 和 PC-01 存在较大遗传差异遥 有研究表明当一个基因刚好位于易位区域边缘时基因会被打断袁 促使基因内区尧 非翻译区域以及编码区域改变袁导致 DNA 序列有较大的改变35遥2.5耐药基因尧致病性基因和环境抗性基因的特征比较基因组学分析可对乳酸菌基因组所含有的耐药尧致病性尧环境抗性等相关基因的结构和功能信息进行分析袁 对乳酸菌在基因层面的安全性进行评估袁 一定程度上能有效地反映供试乳酸菌的生物安全性36-37遥 通过生物信息学分析发现袁Zhang 及其第 0袁25袁50袁75袁100 代菌株的基因组上均检测到了 1 种抗生素外排泵基因 qacj袁
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