DB22∕T 3172.1-2020 流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测第 1 部分:H7N9亚型禽流感病毒(吉林省).pdf
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1、 ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 3172.12020 流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测 第 1 部分:H7N9 亚型禽流感病毒 Real-time RT-PCR detection on HA and NA genes of influenza virus Part 1:H7N9 subtype avian influenza virus 2020 - 10 - 14 发布 2020 - 10 - 30 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 3172.12020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/
2、T 20001.4-2015给出的规则起草。 DB22/T 3172流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测分为四个部分。 第 1 部分:H7N9亚型禽流感病毒; 第 2 部分:H7N4亚型禽流感病毒; 第 3 部分:H3N8亚型马流感病毒; 第 4 部分:H7N7亚型马流感病毒。 本部分为DB22/T 3172的第 1 部分。 本部分由长春海关提出并归口。 本部分起草单位:长春海关技术中心。 本部分主要起草人:王伟利、王准、王玮琳、姚贵哲、刘金华、肖芳、李玥、马文晨、杨帆、蔡阳、马玲。 DB22/T 3172.12020 1 流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测 第 1
3、部分:H7N9 亚型禽流感病毒 1 范围 本标准规定了H7N9亚型禽流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法的原理、 试验条件、 试剂与材料、仪器设备、样品、试验步骤和试验数据处理及试验报告。 本标准适用于H7N9亚型禽流感病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值:每个反应管内的荧光信号达到的设定
4、的阈值时所经历的循环数(Cycle threshold) DEPC:焦磷酸乙二酯(Diethy pyrocarbonate) HA: 血凝素(Hemagglutinin) NA: 神经氨酸酶(Neuraminidase) RNA:核糖核酸(Ribonucleic acid) RT-PCR: 反转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction) Taq 酶:Taq 脱氧核糖核酸聚合酶(Thermusaquaticus DNA polymerase) 4 原理 根据H7N9亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列设计特异引物和探针,探针结
5、合部位在扩增片段内部。HA基因和NA基因探针分别在5端标记FAM和VIC荧光素作为报告荧光基团,3端分别标记TAMRA和MGB作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时,引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq酶发挥53的外切核酸酶功能,将探针降解,探针上的荧光基团游离出来,所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复,PCR产物呈指数形式增长,荧光信号也相应增长。据此荧光PCR仪可实现对HA基因和NA基因的同步实时检测。 5 试验条件 DB22/T 3172.12020 2
6、 5.1 生物安全措施 所有培养物和废弃物的处置应按照GB 19489中的有关规定执行。 5.2 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T 27401的规定。 6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 阴性对照:不含禽流感病毒的鸡胚尿囊液或组织。 6.1.2 阳性对照:体外转录 H7N9 亚型流感病毒非感染性 RNA,-20 保存备用。 6.1.3 2RT-PCR Buffer。 6.1.4 RT Enzyme Mix。 6.1.5 Taq 酶。 6.1.6 DEPC 水:0.1% DEPC 处理后的去离子水。 6.1.7 引物与探针:见表 1: 表1 H7N9 亚型禽流感病毒 HA 基因和 N
7、A 基因引物和探针 引物 F1 5TGCACAGGGAGAGGGAACTG3 引物 R1 5CAAATTGTTGGTTGGTTTTTGC3 HA 基因 探针 P1 FAMTGCAGATTACAAAAGCACTTAMRA 引物 F2 5 GTGGAAGACCCAAGGAGGATAA3 引物 R2 5 CCCATCAGGCCAGTTCCAT3 NA 基因 探针 P2 VICTTCCAGTACAGAGTTCCMGB 6.2 材料 6.2.1 离心管(1.5 mL、0.2 mL)。 6.2.2 荧光 PCR 反应管(0.1 mL、0.2 mL)。 7 仪器设备 7.1 生物安全柜。 7.2 高速冷冻离
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