GSTpull-down实验技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,Western Blot,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,GST pull-down,实验技术,主讲：段志强,GST pull-down,原理,GST pull-down,实验流程,GST pull-down,原理,：,GSTpulldown,是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法。,原理：,利用,DNA,重组技术将已知蛋白与,GST(Glutathione S transferase),融合，融合蛋白通过,GST,与固相化在载体上的,GTH,（,Glutathione,）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。,GST pull-down,原理,：,基本原理：,假定,A,蛋白和,B,蛋白可能有相互作用，将纯化的融合,GST,标签的,A,蛋白和纯化的,B,蛋白以及能特异结合,GST,的,Sephrose4Bbeads,孵育一定时间，充分洗涤未结合的蛋白，煮沸,beads,进行,SDS-PAGE,电泳，通过,Western blotting,检测，可以看见,GST-A,和,B,分别对应的条带,表明,A,和,B,因相互作用而被,GST-Apull-down,；而,GST,对照组始终仅有一个条带。,GST pull-down,示意图,GST pull-down,应用,用于验证两个已知蛋白的相互作用,筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白,GST pull-down,流程,GST-A,融合蛋白的制备,B,蛋白的制备,体外蛋白的结合,Western blot,检测,1.1 GST-A,融合蛋白的表达,1.2 GST-A,融合蛋白的纯化,1.GST-A,融合蛋白的制备,1.1 GST-A,融合蛋白的表达,1,、,活化冻存菌种,GST,和,GST-A,：按,1:50,比例将表达蛋白的冻存菌液加入,5ml LB(Amp,),，,37,，,200 rpm,培养过夜；,2,、将过夜培养物按,1:100,比例接入,200ml LB(Amp,),，,220 rpm,，,30,培养至,OD,600,=0.4-0.6;,3,、以预实验确定的最佳,IPTG,浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（,IPTG 0.5mM,，,20,，,200 rpm,培养,1016,小时）,;,4,、诱导适当时间后，,4,，,5000 rpm/min,离心,10min,后弃上清（如需要该步沉淀能保存在,-80,）；,1.1 GST-A,融合蛋白的表达,5,、重悬沉淀：按,10ml,菌液沉淀用,1ml PBS,重悬，并加入,PMSF,；,6,、冰上超声沉淀重悬液：,5S,间隔,5S,至悬液透明（一般可容性蛋白：,10ml,菌液沉淀用,1ml PBS,重悬液超声,69min,可透明）,;,7,、,12000 rpm/min,，,4,离心,10min,，将上清转移至新的离心管，加,DTT,至终浓度,1mmol/L,。,1.2 GST-A,融合蛋白的纯化,1,、,在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的,50%Glutathione Sepharose 4B,，,4,缓慢摇动，反应,3060min,；,2,、,3000 rpm/min,，,4,离心,3min,，弃上清。该,Sepharose,上结合了,GST-A,融合蛋白。,3,、在管中加入预冷的,200,微升,PBS,（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将,Sepharose,洗涤一次，,3000 rpm/min,，,4,离心,3min,，弃上清,;,4,、重复步骤,3,三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结合有,GST-A,融合蛋白的,Sepharose,；,1.2 GST-A,融合蛋白的纯化,5,、如果用于检测，在,Sepharose,加入,1520,微升,1,蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮,510min,。,6,、,12000 rpm/min,离心,5min,，取上清做,SDS-PAGE,和,WB,检测。,B,蛋白的来源：,1.1(His)-B,融合蛋白的原核表达与纯化,1.2(HA/Myc/Flag)-B,融合蛋白的真核表达,2.B,蛋白的制备,1,、,活化冻存菌种,His,和,His-B,：按,1:50,比例将表达蛋白的冻存菌液加入,5ml LB(Amp,),，,37,，,200 rpm,培养过夜；,2,、将过夜培养物按,1:100,比例接入,200ml LB(Amp,),，,220rpm,，,30,培养至,OD,600,=0.4-0.6;,3,、以预实验确定的最佳,IPTG,浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（,IPTG 0.5mM,，,28,，,200 rpm,培养,1016,小时）,;,4,、诱导适当时间后，,4,，,5000 rpm/min,离心,10min,后弃上清（如需要该步沉淀能保存在,-80,）；,1.1.1(His)-B,融合蛋白的原核表达,5,、重悬沉淀：按,10ml,菌液沉淀用,1ml PBS,重悬，并加入,PMSF,；,6,、冰上超声沉淀重悬液：,5S,间隔,5S,至悬液透明（一般可溶性蛋白：,10ml,菌液沉淀用,1ml PBS,重悬液超声,69min,可透明）,;,7,、,12000 rpm/min,，,4,离心,10min,，将上清转移至新的离心管，加,DTT,至终浓度,1mmol/L,。,1.1.1(His)-B,融合蛋白的原核表达,1.1.2(His)-B,融合蛋白的纯化,1,、,在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的,Ni-NTA,珠子，,4,缓慢摇动，反应,3060min,；,2,、,3000 rpm/min,，,4,离心,5min,，弃上清。该,Ni-NTA,珠子上结合了,His-B,融合蛋白。,3,、在管中加入预冷的,200,微升,Wash Buffer,（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将珠子洗涤一次，,3000 rpm/min,，,4,离心,3min,，弃上清,;,4,、重复步骤,3,三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结合有,His,融合蛋白的,Ni-NTA,；,1.1.2(His)-B,融合蛋白的纯化,5,、加入适量体积,Elution Buffer,，不必吹打，晃动洗脱蛋白。,3000 rpm/min,，,4,离心,5min,，吸净上清，,His-B,融合蛋白即在上清中；,6,、如果用于检测，取,10,微升样品，加入,10,微升,1,蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮,510min,；,7,、,12000 rpm/min,离心,5min,，取上清做,SDS-PAGE,和,WB,检测。,1,、将编码,B,蛋白的,ORF,克隆到编码标签蛋白（如,HA/Myc/Flag,）的真核表达载体上，进行细胞转染；,2,、转染后,3648h,，取出细胞，用预冷,PBS,洗,2,遍,;,3,、加入适量体积,1RIPA,（含,PMSF,），于冰上或,4,裂解细胞,1030min;,4,、,12000 rpm/min,，,4,离心,5min,，取上清保存在,-80,或进行下一步实验。,1.2(HA/Myc/Flag)-B,融合蛋白的真核表达,3.,体外蛋白的结合,1,、,将结合有,GST-A,融合蛋白的,Sepharose 4B,悬浮在适量体积缓冲液中，加入,2030,微升含有,B,蛋白的溶液（原核表达或真核表达产物），同时采用结合有,GST,蛋白的,Sepharose,作为阴性对照,；,2,、,在水平摇床上,4,晃动,48h,；,3,、,3000 rpm/min,，,4,离心,3min,，弃上清（注意不要扰动底层的,Sepharose,）；,4,、加入预冷的,200,微升缓冲液对,Sepharose,进行洗涤（沿壁加入，不要直接冲击,Sepharose,，随后轻柔晃动，使,Sepharose,重悬即可,;,3.,体外蛋白的结合,5,、,3000 rpm/min,，,4,离心,3min,，弃上清（注意不要扰动底层的,Sepharose,）；,6,、重复步骤,5,三次,;,7,、吸干,Sepharose,上面的液体后，加入,2030,微升,1,蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴,4min,，冻存于,-20,备用；,8,、做,SDS-PAGE,和,Western blot,检测另一个蛋白。,4.Western blot,检测,谢谢大家！,