实验-中药制药08-药物制剂08.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,药物制剂,08,、,中药制剂,08,实验室规则,1.,进入实习室实验要穿白大衣,.,2.,除实验中必用的学习用品外,其他物品不要,放在实验台上,.,书包放桌屉内,.,3.,实习室内不允许吃食物或饮料,.,4.,实验中一定要保持实习室安静,彼此讨论问,题时不要大声喧哗,严禁打闹,.,5.,实验过程要按照教师要求进行操作,如有疑,问要请教指导教师,.,6.,爱护实验器材,如有损坏应及时报告教师,需赔偿者按规定办理,.,7.,实验完毕,要清理台面,.,需冲洗的物品按要求冲洗,需收回的物品按要求摆放整齐送回教学准备室,.,8.,值日生要做好值日,离开实习室时,一定要有专人负责关好门窗,水源及照明设备,.,实验一 免疫学实验（,4,学时，,w14,）,【,需带显微镜,】,一、凝集试验,1,人类,ABO,血型鉴定,-,学生操作每人做,二、沉淀试验,1,双向扩散,-,学生操作 每人做,三、普通光学显微镜（油镜）使用和维护,教师示讲,1,架,/,人,四、大小吞噬试验,-,发片观察,2,片,/,台,五、,E,花环试验,-,发片观察,2,片,/,台,六、淋转试验,-,发片观察,2,片,/,台,血清学反应,1,含义,:,抗原和抗体的体外反应,2,特性,:,(1),特异性结合,(2),可逆性结合,(3),需一定条件,:,生理盐水,;,温度,;pH,值,;,合适的抗原抗体比例,3,种类,凝集反应：玻片凝集试验，试管凝集试验等,沉淀反应,:,补体参加的试验：,用标记抗体或抗原进行的反应：,一，凝集试验,-,玻片凝集试验,人类,ABO,血型鉴定,-,学生操作每人做,1,原理：,2,材料,抗体：,抗,A,血清，抗,B,血清,抗原：,自身红细胞,器材：无菌采血针，加生理盐水的洁净小,试管等。,凝集,试验的原理,电解质,颗粒性,Ag,(,细菌、细胞等,),特异性,Ab,Ag/Ab-IC,（,肉眼可见的凝集块）,抗,A,标准血清,抗,B,标准血清,血 型,A,B,AB,O,“”表示红细胞凝集，“”表示红细胞未凝集,ABO,血型鉴定表,3,方法步骤：,采手指血混合于生理盐水,于载玻片滴加抗,A,血清或抗,B,血清,滴加红细胞悬液混匀,室温静置数分钟，观察结果,二，双向琼脂扩散试验双向扩散,-,学生操作 每人做,（检测甲胎蛋白,AFP,）,1,原理,:,可溶性抗原可和抗体在琼脂凝胶中同时向四周自由扩散,(,形成浓度梯度,),在抗原和抗体合适比例处形成白色沉淀线,每一抗原抗体系统只能形成一条沉淀,线,因此能对抗原成分进行精细分析,.,沉淀试验的原理,电解质,特异性,Ab,可溶性,Ag,(,蛋白质等,),Ag/Ab-IC,（,肉眼可见的沉淀物）,2,材料,样品,:,待检人血清,(,抗原,),脐带血清,(AFP,阳性对照,),健康人正常血清,(AFP,阴性对照,),试剂,:AFP,诊断血清,(,抗体,),1.2%,琼脂,:,玻璃板,:,玻璃平皿,:,打孔器：,微量加样器,:,3,方法,:,1,制备琼脂板,:,2,打孔,:,3,将,抗体加入,7,号孔,1,4,号孔加入阳性对照,6,号为阴性对照,2,3,5,号为待检样品,将琼脂板置湿盒于,37,过夜,观察结果,4,结果：,1),1,、,4,孔与,7,孔间应出现白色沉淀线,(,阳性对照,),6,与,7,孔间应不出现白色沉淀线,(,阴性对照,);,2),若,2,、,3,、,5,孔与,7,孔间出现白色沉淀线而且与阳性对照沉淀线吻合,表明待检血清中含有,AFP;,如出现沉淀线,但不与阳性对照吻合，则判定,AFP,阴性；如无沉淀线，也判定为,AFP,阴性。,1,2,3,4,5,6,7,1,2,3,4,5,6,7,1,3,2,4,7,6,1,2,7,3,4,5,6,1,7,2,3,4,5,6,1,2,3,7,4,5,6,三，普通光学显微镜（油镜）的使用和维护,-,教师示讲,1,架,/,人,油镜的使用,:100X,HI,oil,等,香柏油,增加照明亮度：,增加分辩率：,透镜,透镜,玻片,玻片,香柏油,加油前,加油后,显微镜油镜的原理,使用注意事项：,使用油镜观察样品后，随即用二甲苯将油镜镜头和载波片擦净，以防其他的物镜玻璃上沾上香柏油。二甲苯有毒，使用后马上洗手。,四，大小吞噬试验,-,发片观察,2,片,/,台,1,原理：,中性粒细胞：核分叶，细菌染成蓝紫色,（小吞噬）,单核巨噬细胞：紫色或不规则形巨噬细,胞，鸡红细胞核呈淡紫色,（大吞噬）,2,材料：,（,1,）样品：,表皮葡萄球菌；,1%,鸡红细胞,（,2,）吞噬细胞：,人外周静脉血；小鼠腹腔巨噬细胞,（,3,）试剂：,Wright-,Giemsa,染色液等,3,方法：,（,1,）小吞噬：人外周静脉血,+,表皮葡萄球菌悬液,（,2,）大吞噬：小鼠腹腔注射,1%,鸡红细胞,中性粒细胞,大吞噬细胞,10100,鸡红细胞,巨噬细胞,球菌,鸡红细胞,巨噬细胞,巨噬细胞吞噬鸡红细胞,五，,E,花环形成试验,-,发片观察,2,片,/,台,1,原理：,人,T,淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（,SRBC,）,受体（,E,受体，,CD2,），故在一定条件下，,SRBC,能结合在淋巴细胞表面，形似玫瑰花环（,E-,花环），常用于测定,T,细胞数量。,Erythrocyte,红细胞,2,材料：,1,）样品：人静脉血,2,）试剂：,1%SRBC,悬液等,3,）器材：试管等,3,方法（微量法）,1,）粗制淋巴细胞悬液：双蒸水去除红细胞，用,Hanks,液悬浮,2,）加入小牛血清,水浴,1015,分钟,加入,1%SRBC,混合,置,37,水浴,5,分钟,低速离心,5,分钟,滴片或涂片观察,计算,E,花环形成细胞数量,E,花环形成细胞数量,=,花环数,/,淋巴细胞数,E,花 环,T,细胞,sRBC,4,结果：,结合,3,个以上,SRBC,的淋巴细胞为,E,花环细胞,六，,T,淋巴细胞转化试验（淋转）,-,发片,观察，,2,片,/,台,1,原理：,T,淋巴细胞表面具丝裂原,(PHA,等,),受体及,TCR,在,PHA,作用下发生活化,进入有丝分裂期从而增殖,(,淋巴细胞转化,形成淋巴母细胞,):DNA,倍增,染色质疏松,核仁明显,核增大,;,细胞体积增大,胞浆丰富等。可了解机体细胞免疫状态,检测方法,:,形态学法,;,同位素法,(,3,H-TdR),2,材料,1,）样品,:,人静脉血,2,）,RPMI1640,细胞培养基（含,PHA,）,3,）其他器材等,3,方法步骤,(,形态学法,-,全血法,),取人静脉血,0.2ml,加入到,2ml,细胞培养基中,1,瓶加入,PHA(,终浓度,1%),另一瓶为对照,(,等量细胞培养基,),于,37,培养,72,小时,涂片,Wright-,Giemsa,染色，计算淋巴细胞转化率,转化率,=,转化淋巴细胞数,/,淋巴细胞总数,4,结果：,转化细胞细胞形体变大、细胞浆量大大增加并出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等,静止的淋巴细胞,转化的淋巴细胞,淋转试验,实验二 综合性实验：细菌形态观察与分离培养（一）（,4,学时）,一、普通肉汤培养基的制备,-,教师操作并讲解,二、细菌的接种和培养：平板、斜面、半固体和肉汤,-,学生操作,1,套,/,人,三、细菌的培养技术,-,教师示讲,四、细菌的生化反应（糖发酵、,IMViC,、,H,2,S,）,-,结果示教,1,套,/,室,五、消毒与灭菌,-,示范与讲解,培养基,1,含义：,人工配制的能满足细菌及其他微生物生长 繁,殖或累积代谢产物的营养基质。,2,分类：,天然培养基,营养物质来源,合成培养基,液体培养基：无琼脂,物理状态,半固体培养基：,0.30.7%,琼脂,固体培养基：,1.52.5,%,琼脂,基础培养基,用途,营养培养基,选择培养基,鉴别培养基,一，普通肉汤培养基的制备：,示教,1,材料,:,牛肉膏,蛋白胨，氯化钠，蒸馏水等；,2,器材：,pH,试纸，烧瓶，量筒，漏斗，滤纸，试管，,棉塞，平皿,高压蒸汽灭菌器等,3,配方,:,牛肉膏（,0.3,0.5g),蛋白胨,(1g),，氯化,(,0.5g,),，,蒸馏水,(100ml);,调,pH,为,7.4,4,制备过程,:,A,称量,:,B,溶解,:,C,调,pH,值,:,D,过滤,:,E,分装,:,F,高压灭菌：,121,20,分钟以上,G,无菌,检测,:,二，固体或半固体普通肉汤琼脂,培养基的制备：讲解,配方及制备过程,:,在前面所制备普通肉汤培养基中加入琼脂,:,浓度为,0.3,0.7%,可制备成半固体培养基,浓度为,1.5,2.5%,可制备成固体培养基；高压灭菌：,121,20,分钟以上,待培养基冷至,50,60,时，在超净工作台内无菌操作：,斜面培养基：,斜置试管冷却即可（琼脂浓度：,1.5,2.5%,）。,半固体培养基：,直立试管冷却即可（琼脂浓度：,0.3,0.7%,）。,平板培养基：,将固体培养液（琼脂浓度：,1.5,2.5%,）倾注入无菌空平皿，使培养基均匀铺满皿底，盖好皿盖冷却即可。,三，细菌的接种和培养,-,平板、斜面、半固体和肉汤,细菌的分离方法：,稀释法、,平板分区划线法,。,细菌的接种方法：,斜面培养基接种法、液体培养基接种法、穿刺,接种法、,倾注平板法、平板涂布法。,细菌的培养方法：,需氧培养法,CO,2,培养法,厌氧培养法,（一）,平板分区划线法,：,学生操作,1,原理,:,采用在普通肉汤琼脂平板培养基上划,线，将标本中的细菌尽量分散生长以,获得较多的单个菌落。,2,菌种,:,混合菌（大肠杆菌、葡萄球菌）,3,培养基,:,普通平板，练习平板,4,器材,:,接种环,酒精灯等,5,步骤,:,(,1),接种环的火焰灭菌,:,(,2),划线,:,四区（每划一区，需灼烧接种环！）,(,3),培养,:37,18-24,小时,1,区,2,区,3,区,4,区,1,2,3,4,平板分区划线法（学生操作）,（二）斜面培养基接种法：,学生操作,1,目的,:,在肉汤斜面培养基上接种培养细菌,2,菌种,:,葡萄球菌,、,大肠杆菌、志贺菌、沙,门菌疑似菌落等,3,培养基,:,肉汤斜面培养基,4,器材,:,接种环,酒精灯等,5,步骤,:,(,1),接种环的火焰灭菌,:,(,2),划线,:,(,3),培养,:37,18-24,小时,（三）半固体培养基穿刺接种法,学生操作,1,目的,:,在肉汤半固体培养基上接种培养细菌,以观察细菌有无动力等。,2,菌种,:,大肠杆菌,葡萄球菌等,3,培养基,:,肉汤半固体培养基,4,器材,:,接种针,酒精灯等,5,步骤,:,(,1),接种针的火焰灭菌,:,(,2),穿刺,:,(,3),培养,:37,18-24,小时,（四）液体培养基接种法,学生操作,1,目的,:,在肉汤培养基接种培养细菌,2,菌种,:,金黄色葡萄球菌等,3,培养基,:,肉汤培养基,4,器材,:,接种环,酒精灯等,5,步骤,:,(,1),接种环的火焰灭菌,:,(,2),接种细菌,:,(,3),培养,:37,18-24,小时,液体培养基,沉淀生长,混浊生长,表面生长,四，细菌的生化反应（糖发酵，,IMVIC,，,H,2,S,）结果示教,1,套,/,室,（一）糖发酵试验,:,原理：,将某种糖或醇加入蛋白胨水培养基内，同时加入指示剂,溴甲酚紫,pH5.2(,黄色,)-pH6.8(,紫色,),和一只杜氏管；如细菌能利用该糖，则可产酸或,/,和产气。,材料,:,大肠埃希菌，伤寒沙门菌；糖发酵管（葡、乳、麦等）,方法：,将细菌接种于各发酵管中，,37,培养,24,48,小时后观察。,结果：,培养液要变混浊：,紫色：糖发酵为阴性（,-,）,黄色，小管有气泡（产酸，产气）,糖发酵为阳（,+,）,黄色，小管无气泡（产酸，不产气）,大肠埃希菌：（,+,）；伤寒沙门菌：,+,Carbohydrate fermentation,-,（,+,）,+,（二）,IMVIC:,吲哚试验,(,Indole,test):,I,原理：,大肠杆菌等含色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚,能与吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛）反应形成红色的玫瑰吲哚。,材料：,大肠埃希菌，伤寒沙门菌；蛋白胨水培养基；吲哚试剂,方法：,取细菌接种于蛋白胨水培养基中，,37,培养,18,24,小时，沿管壁加入数滴吲哚试剂，即刻观察。,结果：,红色为吲哚试验阳性，无变化为阴性,大肠埃希菌：,I,：,+,；伤寒沙门菌：,I,：,-,Indole,production test,+,-,甲基红试验,(Methyl red,test,MR,),试验,:,M,原理：,有些细菌分解葡萄糖后产酸,(,丙酮酸,乳酸,甲酸等,),使培养基,pH,降低至关重要,4.5,以下,加入甲基红试剂即显红色,(,大肠杆菌,),甲基红试剂,pH,范围,:4.4,6.2,材料：,大肠埃希菌，产气肠杆菌；葡萄糖蛋白胨水培养基；甲基红试剂,方法：,取细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，,37,培养,18,24,小时，沿管壁加入数滴甲基红试剂，即刻观察。,结果：,红色为甲基红试验阳性，桔黄色为阴性,大肠埃希菌：,M,：,+,；产气肠杆菌：,M,：,-,Methyl red test,+,-,VP,试验,:,Vi,原理：,产气杆菌具丙酮酸脱羧酶,可将葡萄糖分解产生的丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在碱性条件下可被氧化成二乙酰,二乙酰可与蛋白胨中精氨酸的胍基作用生成红色化合物,(,-,萘酚可催化此反应,),。,材料：,大肠埃希菌，产气肠杆菌；葡萄糖蛋白胨水培养基；,V-P,试剂（,-,萘酚酒精液，,KOH,液）,方法：,取细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，,37,培养,18,24,小时，沿管壁先加入,1,毫升,-,萘酚酒精液,，再加入,0.4,毫升,KOH,液,充分振荡,室温静置,5,30,分钟观察。,结果：,红色为,V-P,阳性。,大肠埃希菌：,Vi,：,-,；产气肠杆菌：,Vi,：,+,Voges-Proskauer,test,+,-,枸橼酸盐利用试验,(Citrate utilization),：,C,原理：,产气肠杆菌利用枸橼酸盐为碳源,能将枸橼酸盐分解产生,CO2,CO2,再转变成碳酸盐,使培养基成碱性,加入溴麝香草酚蓝作为指示剂,可由绿色变为深蓝色。,材料：,大肠埃希菌，产气肠杆菌；西蒙氏枸橼酸盐培养基（斜面）。,方法：,将细菌接种于西蒙氏枸橼酸盐培养基斜面上，,37,培养,24,48,小时后观察结果。,结果：,斜面上有菌苔，且变成深蓝色，为阳性；斜面上无菌苔，仍是绿色为阴性。,大肠埃希菌：,C,：,-,；产气肠杆菌：,C,：,+,Citrate test,+,+,-,-,硫化氢试验：,原理：,有些细菌能分解含硫氨基酸，产生,H,2,S,，,H,2,S,遇铅或亚铁离子可形成黑色硫化铅或硫化亚铁沉淀,材料：,大肠埃希菌，肖氏沙门菌；醋酸铅半固体培养基,方法：,将细菌接种于醋酸铅半固体培养基，,37,培养,24,48,小时后观察结果。,结果：,培养基为黑色沉淀，即为产硫化氢阳性,大肠埃希菌：,H2S,：,-,；肖氏沙门菌：,H2S,：,+,克氏双糖铁培养基：,（,1,）原理：,克氏双糖铁,(KIA),培养基制成高层和短的斜面，其中葡萄糖含量仅为乳糖或蔗糖的十分之一，若细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖产酸使,pH,降低，因此斜面和底层均先呈黄色，但因葡萄糖量较少，所生成的少量酸可因接触空气而氧化，并因细菌生长繁殖利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面部分又变成红色；底层由于处于缺氧状态，细菌分解葡萄糖所生成的酸类一时不被氧化而仍保持黄色。细菌分解葡萄糖、乳糖或蔗糖产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，且有气泡。细菌产生硫化氢时与培养基中的硫酸亚铁作用，形成黑色的硫化铁。,（,2,）方法：,用接种针挑取待检菌的菌落，先穿刺接种到,KIA,或,TSI,深层，距管底,3,5mm,为止，再从原路退回，在斜面上自下而上划线，置,35,孵 育,18,24h,，观察结果。,五、微生物的控制,（一）高压蒸汽灭菌：,注入适量蒸馏水等,放入需高压灭菌物品，加盖,打开排气阀，加热,排气数分钟（排出空气），关闭排气阀,继续加热，待,121,时，计时，,20,分钟后，停止加热,压力降为零时，开盖取出物品,（二）紫外线杀菌实验,1,原理：,DNA,链上相邻,T,在紫外线作用下可形成,T=T,，可使,DNA,断裂或不能复制。,2,材料,细菌：葡萄球菌或大肠杆菌菌液,无菌普通平板：,无菌棉签：,3,方法：,将用无菌棉签沾取葡萄球菌或大肠杆菌菌液，均匀涂布于普通平板表面，置于超净工作台紫外灯下（皿盖打开约,1/3,），紫外照射,30,分钟后，盖上皿盖于,37,培养,24,小时后观察结果。,实验三 综合性实验：细菌形态观察与分离培养（二）（,4,学时）,一细菌基本形态观察,1,球菌,2,杆菌,3,弧菌,-,发片观察各,2,片,/,台,二细菌特殊形态观察,1,芽孢,2,鞭毛,3,荚膜,-,发片观察各,2,片,/,台,三、革兰氏染色,-,学生在实验二中自己培养的细菌 学生操作 每人做,一、革兰染色,-,上次实验的分离平板培养物 学生操作 每人做,不染色,:,暗视野观察法,细菌观察,单染色法,:,染色,复染色法,:,革兰染色,(Gram stain),、,抗,酸染色,特殊染色法,:,芽胞染色,、,荚膜染色,、,鞭毛染色,革兰染色法,（一）原理,:,结晶紫及碘进入菌细胞壁内形成大分子结晶紫,-,碘复合物。,G+,菌细胞壁肽聚糖厚，脂质少，脱色剂乙醇不易损伤其肽聚糖层，相反乙醇的脱水作用使细胞壁收缩，更阻碍结晶紫,-,碘复合物被乙醇溶出，故菌体呈蓝紫色；,G-,菌细胞壁肽聚糖层薄,、,结构疏松，以脂质外膜为主要结构，乙醇溶解脂质后使细胞壁通透性增高，结晶紫,-,碘复合物被容易乙醇溶出，使细菌脱色，经沙黄染液复染后呈红色（沙黄染液颜色）。,（二）材料,:,1,细菌,:,自己分离的大肠杆菌,、,金黄色葡萄球菌平板,培养物,2,染色液,:,结晶紫染液,碘液,95%,乙醇,沙黄染液,3,器材,:,显微镜,载玻片,接种环,酒精灯等,（三）过程,:,1,制作涂片,涂片,:,干燥：,火焰固定,:,2,染色,初染,:,结晶紫染液覆盖,1,分钟,细水去染液,媒染,:,碘液覆盖,1,分钟,细水去染液,脱色,:95%,乙醇,15,30,秒,关键步骤,!,复染,:,沙黄染液覆盖,1,分钟,细水去染液,（四）,镜检,油镜观察：,葡萄球菌,:,紫色,大肠杆菌,:,红色,二细菌基本形态观察,-,发片观察 各,2,片,/,台,（一）球菌（,coccus,）：,球菌,-,葡萄球菌观察,（二）杆菌（,bacillus,）：,杆菌,-,伤寒杆菌观察,（三）螺形菌,（,spiral bacterium,）：,螺形菌,-,霍乱弧菌观察,三，细菌特殊形态观察,-,发片观察 各,2,片,/,台,（一）芽胞,:,破伤风梭状芽胞杆菌,（二）,鞭毛：,伤寒杆菌,（三）荚膜：,肺炎链球菌,