5.3血红蛋白的提取和分离.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成,这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代。,人类基因组：指DNA分子所携带的全部,遗传信息。,蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究,思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质,的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性、变性、空间结构,血红蛋白的提取和分离,（一）凝胶色谱法（,分配色谱法,）,2.,凝胶：,大多数凝胶是由,多糖类化合物,（如葡聚糖或琼脂糖）构成的微小多孔球体,，,内部有许多贯穿的,通道。,根据被分离物质的,蛋白质相对分子质量的大小，,利用具有,网状结构,的凝胶，来进行分离。,1.,概念：,一、基础知识,3、原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,4、具体过程,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,1、概念：在一定的范围内，能对抗,外来少量强酸、强碱,或稍加稀释不引起溶液,PH,发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,2、作用：,能够抵制（）对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。,外界的酸或碱,PH值,（二）缓冲溶液,3、缓冲溶液的配制,通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲对,？,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,H,2,CO,3,/NaHCO,3,1、概念：指带电粒子在电场作用下发生,迁移的过程。,（三）电泳：,2、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有()在(),下,，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）,移动。,3、本质：,电泳利用了待分离样品中各种分子,（）,以及分子本身,（）、（）,的不同,，,使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的PH,（1）,聚丙稀酰胺凝胶：,是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下,聚合交联成三维网状结构的凝胶,4,.分类：,两种常用的电泳方法:,琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。,聚丙烯酰胺凝胶电泳：,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。,（2）,原理,为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入(),。,SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，,因此测定的结果只是(),。,SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所,带负电荷,的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。,（3）SDS-,聚丙稀酰胺凝胶电泳,作用机理:,单条肽链的分子量,分子的大小,SDS,注意：测定（）通常用十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质相对分子质量,二,、,实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,(一）,.样品处理和粗分离,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐,磷脂,葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,（）,两个a肽链,两个,一,肽链,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,共四条肽链,90,每个肽链环绕一个,亚铁血红素基团，,此基团可携带,一分子氧或一分子二,氧化碳，,血红蛋白因含有,血红素,而,呈,红色。,思考：,（材料的选取）,用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,目的：去除（）,方法：,（）,离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（），将下层（）的红细胞液体倒入（）,1,.,红细胞的洗涤,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,暗红色,烧杯,洗涤过程图解,：,血液,100mL,3g柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,吸出血浆,红细胞,5倍体积生理盐水,搅拌10min,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,再加入,用（）的（）质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤,缓慢搅拌,10MIN，,（）,离心.,五倍体积,如此重复洗涤（）次，直至上清液中已没有（），表明洗涤干净,。,利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。,三,黄色,生理盐水,低速短时间,2,.,血红蛋白的释放,加（）（）体积，再加40体积的（），置于（）上充分搅拌10分钟,细胞破裂释放出血红蛋白.,3,.,分离血红蛋白溶液,：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min，试管中的溶液分为4层:,原血液,甲苯,磁力搅拌器,蒸馏水,第1层：（）甲苯层,第2层：,（）色薄层固体,（）,的沉淀层，,第3层,:,（,）的液体,（）,的水溶液层,第4层,:,其它杂质（）的沉淀层,无色透明,脂溶性物质,白,血红蛋白,红色透明,暗红色,用,过滤 ，除去,，于分液漏斗中静置片刻后，,分出下层的红色透明液体,。,滤纸,脂溶性沉淀层,.分离血红蛋白,分离过程:,红细胞,混合液,高速离心,10min,离心管,滤纸,过滤,脂类物质,烧杯,取()ml的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（）中，pH为（），透析12小时，目的是（）或用于更换样品中的（）。透析袋一般用,硝酸纤维素,制成，又称玻璃纸。,除去样品中分子量较小的杂质,透析袋,磷酸缓冲液,7.0,缓冲液,4.透析,（粗分离）,1,思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是,磷酸缓冲液,，,它的目的是什么？,目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,小结：样品处理和粗分离,1、红细胞的洗涤：,目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。,2、血红蛋白的释放：,在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放,3、分离血红蛋白溶液：,离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。,4、透析：,装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。去除小分子杂质。,（二),.凝胶色谱操作-,-,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3.样品的加入和洗脱,血红蛋白的纯化,材料：,交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液,装填:,2.凝胶色谱柱的装填：,步骤,操作要求,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,3.样品的加入和洗脱,(三）,.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）,判断（）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。,纯化,注意事项,1.红细胞的洗涤：,洗涤次数不能过少；低速、短时离心。,2.凝胶的预处理：,沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡,3.色谱柱的装填：,装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。,4.色谱柱成功标志：,红色区带均匀一致地移动。,为什么？,三、操作提示,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,四、,实验结果分析与评价,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖,2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,课题3 血红蛋白的提取与分离,知识总结,血红蛋白的提取和分离,蛋白质分子的差异性,凝胶色谱法,原 理,分离过程,凝胶电泳法,缓冲溶液,组 成,作 用,蛋白质的,提取分离,样品处理,粗 分 离,纯 化,纯度鉴定,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。,思考,样品的粗分离,纯化,纯度鉴定,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,思考,练习巩固,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是,A 弄清各种蛋白质的空间结构,B 弄清各种蛋白质的功能,C 弄清各种蛋白质的合成过程,D 获得高纯度的蛋白质,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是,A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质,B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质,C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质,D 二者根本无法比较,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于,A 电荷的多少 B 分子的大小,C 肽链的多少 D 分子形状的差异,4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是,A 调节pH B 维持红细胞的能量供应,C 防止微生物生长 D 防止血液凝固,5、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数和CO2分子数分别是,A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1,6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序,自上而下,是：,有,机溶剂-,脂,类物质-,血,红蛋白溶液-,红,细胞破碎物沉淀,7.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个,（）,B,8.凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为16 cm，有关说法中，正确的是 (多选),（）,A一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果,B凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果,C凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度,D凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大,9.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是,（）,A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果,B、气泡阻碍蛋白质的运动,C、气泡与蛋白质发生化学反应,D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密,A,10.样品的加入和洗脱的操作不正确的是,（）,A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面,B加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内,C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口,D用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面,A,11.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（）,A可采集猪血作为实验材料 B用蒸馏水重复洗涤红细胞,C血红蛋白释放后应低速短时间离心 D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液,A,12.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是(,),A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径,B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度,C.将酶或细胞固定在凝胶中,D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度,13.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是(,),A.使酶的活性最高 B.使蛋白质的活性最高,C.维持蛋白质所带的电荷 D.使蛋白质带上电荷,14.甲种蛋白质是由一条多肽构成，共有100个氨基酸；乙种蛋白质是由三条多肽构成，也含有100个氨基酸且种类和数量都相等，若有一凝胶色谱柱能分离出这两种蛋白质，则洗脱时(,),A.甲先被洗脱 B.乙先被洗脱,C.甲乙同时被洗脱 D.无法判断,A,C,B,