流式细胞术简介.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,流式细胞术简介,张林西生命科学研究中心,0 Background,流式细胞术（,Flow,Cytometry,，,FCM,）,是,70,年代,发展起来的一种,快速对单细胞定量分析和分选的新技术,，能,定量分析,细胞的生物化学成分。其检测速度之快、统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的。可同时从一个细胞中测得,多种参数,（如,DNA,、,RNA,、蛋白质,、,细胞体积等）进行多参数分析，为,细胞生物学和生物医学,的研究提供了强有力的手段。,在,80,年代，,流式细胞术已经广泛应用于,基础和临床医学,的研究，使之成为切实可行的有效的研究方法。,FCM,在医学领域中得到广泛推广应用。例如 在,免疫学,、,细胞遗传学,、,肿瘤学,、,病理学,、,放射生物学,等学科。并形成了独特的学科分支，诸如,流式免疫学,、,流式遗传学,、,流式病理学,、,流式细胞酶学,等。,近年来，随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使,FCM,技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其它蛋白质的出现，为,FCM,研究各种组织细胞 膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径。,新的肿瘤标志物的不断出现，大大提高了,FCM,在医学领域的的研究水平。其发展速度之快，应用层出不穷。,FCM,是集现代电子物理技术,、,激光技术,、,电子计算机技术和流体力学等于一身的高科技仪器，开创了荧光技术的又一个崭新的领域。,近年来，此项技术发展十分迅速。具有更高灵敏度、更高分辨率、双激光、多荧光参数分析的仪器不断问世，并在朝着经济实用、操作简便、小巧精制、自动化程度高的方向发展。,确信，流式细胞分析技术进一步与其它技术的结合，将极大的推动生物医学的发展,。,First commercial FCM,FCM papers,一、流式细胞仪,品牌、型号简介,1.BD(,Beckton,Dickinson),公司,1973,年 第一台：,FACS,I,（,Fluorescence Activated Cell Sorter,）,1980,年 中国第一台：,FACS II,市场占有率：全球,75%,，中国,70%,2.Beckman Coulter,公司：,逐年增多趋势,?,？,流式细胞仪主要厂商,荧光激活细胞分选仪,（,Fluorescence activated cell sorter,FACS,）,名称介绍,流式细胞仪的发展，从开始的设想到第一台仪器的问世，经历了几十年的时间。随着现代激光技术、电子检测技术和电子计算机技术的迅速发展，该技术在近些年来有了迅速的发展，成为目前比较完善的细胞分析工具。,1.,临床型（台式机）,特点：光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易掌握,2.,科研型（大型机）,特点：分辨率高，选配多种波长和类型激光器，可感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上，适用于科研。,新型仪器特点：仪器选,2-4,根激光，可检测,13,种荧光参数，,15,种参数。,适用于高速分选和多色分析。,自动化程度很高，提高工作效率。,流式细胞仪分类：,FACS Analyzer,FACS,FACS,FACS 420,440,FACSstar,FACScan,FACSstar,+,FACSsort,FACSVantage,FACSCalibur,FACSVantage,SE BD LSR,FACSVantage,DiVa,BD LSR ,FACSAria,FACScanto,流式细胞计的进展,B-D,公司流式细胞计系列,EPICS XL/XL-MCL,台式机,CytomicsTM,FC 500,系列,最新型,EPICS,Altra,细胞分选仪,大型科研型,Coulter,公司,不同型号流式细胞仪,FACSCalibur,LSRII,FACSAria,FACSCo,unt,FACSVantage&DiVa,FACSC,anto,BD,公司不同型号流式细胞仪,FACSCalibur,(,单激光）,FACSCalibur,BD,FACSCalibur,System,本仪器系统（,The BD,FACSCalibur,TM,system,）是,BD,公司的另一个第一：唯一的四色、双激光台式机，可进行,细胞分析及分选,。特别为更大范围的应用而设计。本仪器是一个完全的同时进行多参数分析系统。,本仪器系统结合了唯一的双激光技术、自动化的上样功能及强大的软件，可满足临床实验室高度工作效率的需要。本系统的可调节及创新性技术还可以为研究者提供广泛的研究需要及灵活型需求。,本仪器能够满足目前的临床及研究需求。它的灵活性可达到你将来的需求。,本系统,：,容纳,3,色或,4,色荧光,BD,FACStation,TM,数据管理系统,灵活性及可升级性,BD LSR,BD LSR II System,本仪器系统（,The BD LSR II,）,可最多配置,4,根激光、具有检测高达,18,色的能力。本仪器可配置,488 nm,405 nm,633 nm,and 355nm UV,激光。本仪器核心是新的数字化电子元件。本电子元件在,16,384,分散水平可数字化信号达到,1,千万次秒，这样扩大了通道处理能力及增加了检测的敏感性。电子死亡时间被消除了，可进行更精确的荧光测量。这样增进了荧光测量线性、补偿及量化。,BD LSR II System,高达,18,色检测；,数字化获取及分心系统；,灵活性及将来的可升级性。,激光选择,:,355nm UV,405 nm,633 nm,BD,FACSArray,Bioanalyzer,System,BD,FACSArray,Bioanalyzer,System:,快速的微量滴定板,sampler*,6,参数检测（包括散射光及荧光）；,直观的软件系统；,数字化信号处理，可高达,15,000,秒。,台式组合结构。,BD,FACSCanto,Tomorrows flow,cytometer,.today!,BD,FACSCanto,flow,cytometer,BD,公司自从,1974,年,第一台商用流式细胞仪问世一直致力于流式细胞仪的创新。,BD,FACSCanto,benchtop,flow,cytometer,继承了这个传统。它的主要特这是：,1.,真,6,色容纳能力,从少量的样品量中获取每个细胞更多的信息。,2.,敏感性,(50 MESF PE,100 MESF FITC*),解决最微弱的,events,。,3.,快速,(10,000 events/sec),加速稀少事件的获取。,4.Low carryover(0.1%),使样品污染最小化。,5.,更换透镜键盘化,不用工具更换滤光片。,6.Fixed optical alignment,免除用户调节。,7.,日常管理自动化,为科研节约更多时间。,BD,FACSVantage,SE flow,cytometry,system,BD,FACSVantage,SE flow,cytometry,system,High-performance,high-speed cell sorter,The BD,FACSVantage,TM,SE flow,cytometry,system is the superior cell-sorting instrument for the research laboratory.For over 25 years,BD cell sorters have been the gold standard and are found in leading university,pharmaceutical,and biotechnology research facilities throughout the world.,To meet the research demands of today,we have improved the BD FACS,Vantage,TM,and added options that customize it.The result is the BD,FACSVantage,SE,a flow,cytometer,that performs with maximum flexibility and reliability.All of this technology is accessible through a familiar user interface and efficient ergonomic design.The BD,FACSVantage,SE flow,cytometry,system is fully modular,for the needs of today and beyond.,多色分析及分选；,BD,FACStation,TM,System,数据管理系统；,灵活性及可升级性；,非,矩形分选窗口,。,FACS Vantage,DiVa,FACSAria,The BD,FACSAria,TM,cell sorter sets a new standard for high performance flow,cytometry,.Based on a revolutionary new design in instrumentation,this easy-to-use,benchtop,system delivers,high-speed sorting,and,multicolor analysis.,The BD,FACSAria,instrument is the first,benchtop,sorter that incorporates a fixed-alignment,cuvette,flow cell.This new flow cell provides superior fluorescence sensitivity.The fixed optical system offers freedom from instrument maintenance and alignment.Sort setup and sort monitoring features in the system software make the BD,FACSAria,instrument easy to use.,BD,TM,AccuDrop,is integrated into the system for,quick and accurate drop-delay,determination.Stream monitoringof the,breakoff,point and clog detection are incorporated for,walkaway,sorting.,第一个,benchtop,高速分选仪，有固定的线性流动细胞杯；,Cuvette,（,小杯）,flow cell,更好的荧光敏感性；,多至空气制冷的,3,根激光（,488-nm,633-nm,and 407-nm,波长）；,数字化获取速率高达,70,000 events/second,；,多色分析，最多可达到,15,个参数,；,2,路和,4,路,批量分选装置,；,Optional BD,TM,Automated Cell Deposition Unit(ACDU),用来进行分选到,BD,Multiwell,TM,板或光镜的载玻片上；,可获得的气雾剂管理选择（,AvailableBD,TM,）；,无需特别的设备。,FCM,自动细胞分离器,BD FACS,Lyse,Wash Assistant with Larger Tank IVD,Features of the BD FACS,Lyse,/Wash Assistant with Larger Tank Option,（,特点）：,Lyses,（,溶解）,Mixes,（,混合）,Washes,（,洗涤）,Incubates,（,孵育）,Fixes,（,固定）,Removes,RBCs,hemoglobin,platelets,and unbound antibody,（,去除红细胞、血红蛋白、血小板和未结合的抗体）。,Saves valuable time when compared to manual method,（,与手工方法比较，节省大量宝贵时间）。,Processes four full loader racks(160 samples)without having to change fluids,（,处理,160,份样本而不用更换液体）。,The BD FACS,Lyse,/Wash Assistant,（,本系统）使样本准备自动化。它可溶解、混合、洗涤及固定样品，使你轻松进行流式细胞仪分析。,应用更大的,tanks,选择，可使实验室效率显著提高。你可同时运行,4,个,loader racks(160,个样本,),而不必更换液体。较大的,tanks,可轻松与,LWA,（,本仪器）融为一体，且较大的,tanks,垂直放置于一个箱体内最大程度地节省了空间。,选择,5,个既定程序之一或创建多至,10,个客户程序以满足您实验室的需要。同时可处理最多,40,份样本。获专利的细胞洗涤技术省去了样本需转到离心机进行离心。这样增加了自由时间同时提高了实验室效率）。,本仪器系统：强大的自动化样本准备解决方案。,BD,MediMachine,System,BD,Medimachine,System,The BD,TM,Medimachine,system is a sample preparation system for the automated,mechanical disaggregation of solid animal or plant tissues for flow,cytometric,analysis,cell culture,or DNA amplification.,The BD,Medimachine,system consists of three components:,the,Medimachine,Medicons,and,Filcons,.,Various pore sizes of disposable,sterile,and non-sterile,Medicons,and,Filcons,allow the operator to optimize experimental conditions to suit the tissue under study,ensuring clean,viable preparations of single cells,cell clusters,or cell nuclei.The procedure is fast and simple.,Features of the BD,Medimachine,System,Prepares tissue quickly and automatically,Standardizes tissue disaggregation,Is easy to use,Can be used with or without enzymes,BD FACS Aria III,持续创新的流式细胞分选仪,BD,FACSAria,III,BD FACS Aria III,是基于专利的稳定性光路技术、卓越的多色分析和分选性能、非凡的自动化操作的基础上创新而成,最新一代流式细胞分选平台,，是,BD FACS Aria,系列高端流式细胞分选仪在分选领域的最新成功力作。,自,2003,年第一台,BD FACS Aria,问世以来，,每一次更新换代都使复杂的分选应用扩展到更加宽广的研究领域，拓展了更广的应用范围。现在，全新的,BD FACS Aria III,功能更强大、性能更可靠、拥有超乎想象的可操作性。,详细参数指标,全球第一台台式高速细胞分选仪，使用石英杯流动检测池固定光路校准技术，不需每日调整光路，仪器随开随用。,石英杯流动检测池荧光检测灵敏度度及佳，,125 MESF;,可以使用达三根激光：激光波长为,488nm,、,633nm,和,407nm.,获取速度达,70,000,细胞,/,秒，分析速度达,50,000,细胞,/,秒,;,多色分析，分析参数可达,15,色之多,;,完全数字化电子处理系统，分辨率达,262,144,道，分选精度达,1/32,液滴,;,液流系统车装载鞘液、废液和洗液，液流自动控制系统，软件自动清洗程序,;,进样仓自动加压，自动混匀样本，自动冲洗进样管路,;,喷嘴选择,70mm,或,100mm,，满足绝大多数细胞分选的要求，喷嘴拆换简便、精确,;,两管或四管分选，可以使用多种规格的收集管,;,配件,BD ACDU,装置，可以在微孔板或载波片上定量分选细胞,;,软件自动仪器控制和计算分选设置，液滴监控，自动检查堵塞,;,样本和分选细胞冷却系统,;,配件,BD AMO,，工作时控制浮质，避免污染,;,工作无特殊环境要求，不需要额外辅助设备,.,技术参数,BD,FACSAria,流式细胞分选仪为流式细胞仪高速分选和多色分析技术设定了更新更高的标准。仪器的设计采用全新理念，极大地简化了高速分选和多色分析的操作和实验要求。,BD,FACSAria,流式细胞仪是全球独一无二的台式高速细胞分选仪，使用石英杯流动检测池固定光路校准技术。其荧光检测灵敏度度极佳，而仪器维护和调校却非常简单。,BD,FACSAria,流式细胞仪系统软件的分选设定和监测功能大大简化了操作。仪器内置的,BD,AccuDrop,系统可以快速准确地确定液滴延迟时间。液流监测系统自动监测液流断点，检查堵塞，,实现了细胞分选的无人操作,。,流,式细胞术是对单个细胞和其他生物微粒进行快速定量分析和分选的学问。这种分析和分选是一种过程。这个过程中经过处理的细胞和微粒被包在鞘液中通过一个聚焦的光源被激发出散射光荧光，进而通过各种光学敏感元件测量这些光强度达到测量其物理性质和化学性质的目的，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群。,实现这个过程的仪器叫流式细胞计。,二、流式细胞术的一般介绍,1,.,什么是流式细胞术？,流式细胞术（,Flow,Cytometry,，,FCM,）,利用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。,流式细胞仪,（,Flow,Cytometer,),集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,只要是,单细胞悬液,均可分析,高速：,分析速度最高达,上万个细胞,/,秒,单细胞中,同时,测定,多个参数,精度高、准确性好,（与传统荧光镜相比）,当代最先进的,细胞定量分析,技术。,同时测定,液相中多种可溶性成分,：流式微球芯片技术,2.FCM,特点：,FSC,前向角散射光,(Forward Light Scatter),SSC,侧向角散射光,(Side Scatter),FL1,荧光,1(Fluorescence1),FL2,荧光,2(Fluorescence2),FLn,荧光,n(Fluorescence n),3.,流式细胞计的参数,(,原理还要介绍）,细胞的相对大小和截面积的大小。因为在前向主要为光的衍射作用，这一方向细胞经过激光后形成衍射环。测量光波长定了，喷嘴和前向的距离不变后。细胞的大小和衍射环大小有一定关系。要注意,FSC,SSC,点图，有时它含许多有意义的内容。,4.FSC,的物理意义,双激光七参数流式细胞计光路示意图,三激光八参数流式细胞计光路示意图,1,细胞,DNA,含量、倍体及细胞周期分析；,2,细胞内钙离子浓度、,pH,测定。,3,检测癌基因与抗癌基因表达在肿瘤发生、发展过程中的作用；,4,细胞凋亡；,5,化疗药物作用机制及疗效评价；,6,白细胞分型、白血病、淋巴瘤研究；,7,网织红细胞计数，血小板疾病诊断；,8 HLA,群体分析；,9 AIDS,研究等。,10,细胞分选,三、主要功能及适用领域,细胞生物学,免疫学,遗传学,药理学,肿瘤学,血液学,病理学,临床检验,植物学,海洋生物学,流式细胞术应用学科领域：,临床研究：,1.,淋巴细胞亚群测定,（绝对数、相对数）,2.,血小板分析,（活化、聚集、微粒、膜糖蛋白）,3.,网织红细胞分析：,派若宁,Y,标记，测定,Reticulocyte,中,RNA,4.,白血病、淋巴瘤免疫分型：,多色标记检测膜或胞,+,质内抗原,5.HLA-B27,分析：,强直性脊柱炎诊断参考依据,6.PNH,诊断,（阵发性睡眠性血红蛋白尿）：检测,CD55,、,CD59,7.,人类同种异体器官移植中应用,（供体选择、术后排斥反应监测、指导临床治疗）,8.,细胞因子测定,（肿瘤、肾炎、感染、自身免疫病、超敏反应、移植排斥反应等）,9.AIDS,诊断与治疗,：,CD4,+,T,数量减少,、,CD8,+,T,中,CD38,分子数增多,10.,疗效评价,（寄生虫、营养失调、创伤、手术、放化疗、疫苗）,11.flow-FISH,法测定端粒长度：,用荧光标记核酸,-,（,CCCTAA,）,3,端粒序列特异探针，应用于肿瘤研究,基础研究：,1.,淋巴细胞功能研究,：,Th1,、,Th2,、,Tc1,、,Tc2,、,NK1,、,NK2,、,NKT,2.,树突状细胞,（,DC,）,研究：,3.,造血干细胞研究,4.,细胞周期分析,：,G,0,G,1,、,S,、,G,2,M,期的,DNA,含量,5.,细胞,DNA,倍体性分析,（肿瘤异,倍体）,6.,细胞凋亡分析,（,Caspase-3,、,Annexin,/PI,、,TUNNEL,、,APO-,BrdU,、,APO-DIRECT,）,7.,凋亡相关蛋白分析,（,Fas,、,Bcl-2,、,P53,）,8.,细胞功能研究,（细胞,内,PH,值、细胞内钙离子流、细胞膜电位、线粒体膜电位）,9.,多药耐药基因研究（,MDR,）：,P170,蛋白、,MDR-1,基因检测,10.,肿瘤相关基因表达研究,11.RNA,测定,12.DNA,测定,13.,总蛋白测定,14.,癌基因、抑癌基因表达产物测定,：,(,Myc,基因组,、,ras,基因,组、,P53,、,c-erbB2,基因,、,HER-2/new,蛋白）,15.,血管内皮细胞研究,四、常见荧光素及其应用,常用荧光染料光谱,FLUOROCHROME,EX.,EM.,APPLICATION,Indo-1(unbound),335,490,Calcium Flux,Indo-1(Bound to Calcium),335,405,Calcium Flux,Hoechst 33342,350,470,DNA analysis,DAPI,359,462,DNA analysis,Alexa350,350,442,Phenotyping,PerCP,470,670,Phenotyping,R-,Phycoerythrin,480,578,Phenotyping,Green Fluorescent Protein(GFP),488,510,Reporter molecule,YO-PRO-1,488,510,Apoptosis analysis,Fluorescein,diacetate,488,530,Cell viability,Alexa488,488,530,Phenotyping,Sytox,Green,488,530,DNA analysis,常见荧光素及其应用,SNARF-1,488,530-640,pH measurement,Fluo-3,488,530,Calcium flux,dsRED,488,588,Reporter molecule,PE-Cy5(,TriColor,Cychrome,),488,670,Phenotyping,PE-Cy7,488,770,Phenotyping,Propidium,Iodide,495,637,DNA analysis,Rhodamine,123,515,525,Membrane potential,Yellow Fluorescent Protein(YFP),519,534,Reporter molecule,LDS-751,543,712,Nucleated cell detection,7-Aminoactinomycin D,546,655,DNA analysis,Alexa,546,546,573,Phenotyping,Cy3,550,565,Phenotyping,CMXRos,(,Mitotracker,Red),560,610,Mitochondrial membrane potential,Texas Red,596,615,Phenotyping,TO-PRO-3,643,661,DNA analysis,Alexa,647,647,667,Phenotyping,APC-Cy7,647,774,Phenotyping,Allophycocyanin,(APC),650,660,Phenotyping,一个学习流式的网站,,网址,,