电镜三维重构I教育课件.ppt

,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,电镜三维重构IPPT讲座,数学工具,函数,富里叶变换,富里叶变换的性质,富里叶变换的例子,卷积定理、相关函数,函数,定义：,（,a,在,x,积分区间内）,函数例子,例,1,例,2,函数的简单性质,函数的简单性质,三维,函数,r,0,点在积分体积内,三维,函数在不同坐标系中的表示,在直角坐标系,在柱坐标系,在球坐标系,函数与晶体,一维晶体：,三维晶体：,二维晶体：,富里叶变换,函数,(,r,),与,F,(,H,),满足如下的变换关系：,F,(,H,),称为,(,r,),的富里叶变换，记为,(,r,),为,F,(,H,),的反富里叶变换,一维富里叶变换,二维富里叶变换,可逆,已知,F,(,H,),，则可以导出,(,r,),富里叶变换的性质,-,1.,乘以常数,特例：,推论：相衬相反的两张像，富里叶变换的振幅相同，但相位相反。因此，冰包埋样品和负染样品的富里叶变换的相角相差,180,o,2.,线性性质,特例：,c,1,=1,c,2,=1,若,p,和,h,分别表示蛋白质和重金属原子的电子密度，上式,左边则代表重原子衍生物的电子密度的富里叶积分，右边,p,和,h,分别为蛋白质和,重金属原子,的电子密度的富里叶变换。,从实验测定,重原子衍生物和重金属原子,的电子密度的富里叶,变换，由上式就可以测定蛋白质的结构。,3.,相似性质,放大,/,压缩一个物体，其富里叶变换相应的缩小,/,放大,4.,位移物体的富里叶变换,样品的漂移改变其富里叶变换的相位，但不改变振幅，因此对形成的像有影响，而对电子衍射图没有影响,5.,旋转物体的富里叶变换,旋转一个物体,角，其富里叶变换相应旋转,角,6.,实函数的富里叶变换,若,(,r,),是一个实函数，则其富里叶变换满足,:,又,，,|,F,(,H,)|,通常被称为振幅,H,为相位。上式表明中心对称的两个衍射点之间,的关系为：,只需记录一半的衍射数据,富里叶变换例子,-1.,函数,一个,函数：,二个,函数：,x,k,N,个,函数,无穷个,函数,2.,盒子的富里叶变换,-a/2,a/2,过氧化氢酶的,高分辨像,强暴光和弱曝光下的衍射图,(Erikson and Klug,1971),高分辨像和电子衍射图,Bacterial rhodopsin in glucose,Fourier transform of image.,电子衍射图包含的信息,衍射点的位置,-,晶胞的大小和形状,电子衍射图包含的信息,衍射点的位置,-,晶胞的大小和形状,衍射点强度及背景的强度,-,信噪比,电子衍射图包含的信息,衍射点的位置,-,晶胞的大小和形状,衍射点强度及背景的强度,-,信噪比,最远能分辨的衍射点,-,分辨率,电子衍射图包含的信息,衍射点的位置,-,晶胞的大小和形状,衍射点强度及背景的强度,-,信噪比,最远能分辨的衍射点,-,分辨率,Thon ring-,离焦值,电子衍射图包含的信息,衍射点的位置,-,晶胞的大小和形状,衍射点强度及背景的强度,-,信噪比,最远能分辨的衍射点,-,分辨率,Thon ring-,离焦值,椭圆,Thon ring-,像散值,卷积定理、相关函数,卷积定义,卷积定理,分子,=f(,r,),分子与晶格的卷积,f(r)*l(r),晶格,=l(,r,),相关函数,定义,特例：自相关函数,主要应用：,Patterson,函数；晶格畸变矫正；测定一个投影像,的方位角。,累了吗,?,休息一会,透射电镜,透射电镜发展简史,透射电镜的构造,光源与分辨率,与扫描电镜的区别,电镜三维重构技术的发展史,1924 De.Broglie,提出物质波理论，并被电子衍射实验证实,1926,年,H.Busch,提出轴对称磁场可以汇聚电子束，并服从几何光学定律,1932,年,E.Ruska,研制出第一台电子显微镜,20,世纪,30,年代，晶体衍射分析,1949,年，,Bacl,2,H,2,o,晶体结构,1968,年，,Klug&DeRosier,，烟草花叶病毒。首次提出电镜三维重构方法。,电镜三维重构技术的发展史,1975,年，,Henderson,和,Unwin,重构了细菌视紫红质,(Bacteriorhodopson),的,7,分辨率的三维结构。,-,电子晶体学的一个里程碑。,1982,年，,Klug,获得诺贝尔化学奖。,1990,年，,Henderson,等人把细菌视紫红质的研究提高到了,3.5,分辨率，并提出了原子模型。,1994,，,Khlbrandt&Wang,，,LHC-II,，,3.4,2005,，,Thomas Waltz,，,APQ0,，,1.9,透射电镜的构造,光源与分辨率,-,可见光,可见光波长（,390nm-780nm,），分辨率由下式决定：,分辨极限：,n,=1,=90,=390 nm,光源与分辨率,-X-ray,晶体结构分析中常用,X-ray,的波长（,0.05 nm 0.25 nm),分辨率用下式估算：,分辨极限：,=90,，,=0.05,光源与分辨率,-,电子束,电子枪示意图,电子的波长：,V,为加速电压（伏特），,波长的单位为,V,(kv),(),-,50 0.0548,100 0.0388,200 0.0251,400 0.0164,1000 0.0123,透射电镜分辨率,点分辨率,分辨率由电子波长和球差系数决定。,分辨率由电子波长和球差系数决定。,特例：,JEOL-100CX,，,C,s,=1.2 mm,V,=100 kV,r,d,=,3.3,各种光源的分辨极限,光学显微镜分辨率低于,0.2,m,X-ray,分析范围低于,0.5,电镜的分辨率低于,1.9,与扫描电镜的区别,入射电子束,二次电子,背散射电子,入射电子束,透射电子束,衍射电子束,扫描电镜,透射电镜,与扫描电镜的区别,成像原理不同。透射电镜与样品的原子核相互作用，而扫描电镜与样品相互作用，使样品中的原子外层电子受激发，产生二次电子成像。,分辨率不同。透射电镜可达到,1.0,，而扫描电镜在,1560,之内。,观察的面积不同。透射电镜的视野范围在,0.1,微米到,1,毫米，而扫描电镜可达,10,微米到,10,毫米,样品的制备不同。透射电镜的样品一般在几百埃内，而扫描电镜没有厚度的限制。,样品的辐射损伤不同。透射电镜对样品的损伤大，而扫描电镜比较小。,原来电镜这么简单,高分辨电子显微像的成像原理,入射电子束与样品的相互作用,运动学电子衍射理论,物镜的成像原理,理想物镜的成像,衬度传递函数,像衬近似理论,弱相位体近似,高分辨电子显微像的成像原理,高分辨电子显微像的成像原理,电子波从物体的后表面传播至物镜前表面；,从物镜的前平面传播至物镜后平面；,电子波传播到物镜的后焦面形成衍射波；,各种像差对衍射波的调制；,被调制的衍射波传播至像平面，干涉形成像面波。像面波振幅的平方就是像的强度。,入射电子束与样品的相互作用,非弹性散射,弹性散射,-25 eV,用,e,和,i,表示弹性和非弹性,散射的散射截面,Z,为原子序数。对于生物样品，大多数原子的,Z,小于,19,，因此，非弹性散射占主导地位。,入射电子束与样品的相互作用,入射电子束经过样品受到弹性和非弹性散射。入射电子与原子核势场的相互作用通常为弹性散射，电子的波长不变。电子与样品的外层电子发生非弹性散射，散射后电子的波长会发生改变，同时，一部分能量,(,约,25 ev),会传递给样品。,弹性散射产生的相干作用形成高分辨电子显微像的衬度和电子衍射花样。非弹性散射则在电子衍射花样上产生一径向分布的背景噪音。,原子序数越小，非弹性散射越大。对于生物样品，因此非弹性散射占主导地位，使得生物样品易受辐射损伤，形成衬度较差。,运动学电子衍射理论,-,运动学近似,散射线的强度远低于入射线的强度。不考虑入射波和散射波的相互作用。,只处理一次散射过程。不考虑散射波的二次散射或高次散射。,源点和场点到散射体的距离足够远，因此入射波可用平面波近似；散射体或散射系统的线度很小，可以看作质点。,运动学电子衍射理论,-,主要结论,电子散射振幅是散射势场的傅里叶变换,对于晶体，衍射的强度等于结构振幅的平方乘以干涉函数,散,射,势,场,(,r,),入射波,出射波,散射势场,电子散射振幅,FT,2/a,衍射强度的分布,物镜的成像原理,-,理想物镜,物平面,后焦面,像平面,u,v,f,q,(,r,),Q,(,r,),(,r,),没有像差，且在高斯面上成像，即满足：,物镜的成像原理,-,理想物镜,电子波从物体的后表面传播至物镜前表面；,从物镜的前平面传播至物镜后平面；,电子波传播到物镜的后焦面形成衍射波；,衍射波传播至像平面，干涉形成像面波。像面波振幅的平方就是像的强度。,物镜的成像原理,-,理想物镜,像平面上的波函数与后焦面上的,也是富里叶变换关系,后焦面上的波函数与物面波是富,里叶变换关系,因此，,像平面所成的是放大倒立的像,物平面,后焦面,像平面,u,v,f,q,(,r,),Q,(,r,),(,r,),衬度传递函数,-,像差,成像平面不是在高斯面上（,(,离焦）,物镜对远轴和近轴电子束会聚能力的不同（球差）,电子透镜不是严格意义上的轴对称，导致沿不同方位的焦距不同（像散）,物镜光栏对参与成像的衍射束数目的限制（光栏函数）,电子束不可能具有完全的时间相干性（时间衰减包络）,电子束没有完全的空间相干性（空间衰减包络）,衬度传递函数,-,像差,物平面,后焦面,像平面,u,v,f,q,(,r,),Q,(,r,),W,(,r,),(,r,),物距与像距不再满足：,像平面上的波函数与后焦面上,的仍然满足富里叶变换关系,其中,W,(,u,),为传递函数，一般由相位和振幅两部分的贡献组成,像差,-1.,离焦,物距,u,与像距,v,不满足高斯公式,物面波函数传播,f,的距离到达,像的共轭面，即,u,v,f,u,当,f=u-f,0,叫做过焦，反之，当,f=u-f,0,，叫做欠焦。由,离焦在后焦面上引起的相位差为,像差,-2.,球差,1,2,透镜的球差用球差系数来描述，,因球差在后焦面上引起的相位,差为,离焦和球差对后焦面上的相位差的综合贡献为,弱相位体近似,物平面,后焦面,像平面,u,v,f,q,(,r,),Q,(,r,),W,(,r,),(,r,),假如样品足够薄，散射势场,(,r,)1,，可以把物体视,为相位体，即入射电子波与,样品相互作用后，只有波的,相位改变，而振幅不变，因,此，物后表面的波函数为,由于,(,r,)1,上式的一次近,似为,弱相位体近似,物平面,后焦面,像平面,u,v,f,q,(,r,),Q,(,r,),W,(,r,),(,r,),后焦面上的衍射波为物后表,面波的傅立叶变换，即,考虑传递函数的作用，后焦,面上被调制的波函数为,像面波是被调制的衍射波的,傅立叶变换，即,弱相位体近似,最后，像平面上的强度,即观察的强度为,上式是弱相位体产生的相位衬度。进一步考虑吸收效应，像,强度中增加一项振幅衬度，改变为,从上式定义衬度传递函数为,衬度传递函数,弱相位体近似,结构信息经过透镜后受到衬度传递函数的调制，因此，像一般并不等同于真实的结构。,对于轻元素组成的薄样品，像的衬度等于样品的势函数与衬度传递函数的傅里叶变换的卷积,当离焦值为零时，没有衬度,在,Scherzer,条件下，衬度传递函数在相当大的空间频率范围,内接近,-1,，此时像的强度对应于物体的结构像。此时的欠,焦值为,不是我不明白，是世界变化太快！,高分辨电子显微镜的图像处理,选择高分辨像,消除背景噪音,测定及消除,CTF,的影响,提高分辨率,选择高分辨像,二维晶体（,2D crystals,）,观察,FFT,的衍射点是否清晰,分辨率是否达到要求,衍射点的对称性,螺旋丝状结构（,Helical Filaments,）,长、直,均匀,层线的分辨率是否达到要求,单颗粒（,single particle,）,均匀,(homogenous),方差,互相关系数,消除背景噪音,消除背景噪音,-,二维晶体,FT,消除背景噪音,-,二维晶体,放大,滤波,消除背景噪音,-,二维晶体,原始像,滤波像（滤波半径,=1,）,消除背景噪音,-,二维晶体,原始像,滤波像（滤波半径,=7,）,消除背景噪音,-,单颗粒,对像的,FFT,做高通和低通滤波,设置频率在高端和底端的阈值,对大量取向一致的粒子像做平均,消除背景噪音,-,单颗粒,平均,测定及消除,CTF,的影响,测定,CTF,Thon Ring,比较高分辨像与,X-ray,的数据,振幅残差法,直接法,最大熵,消除,CTF,FT,u,0,消除,CTF,a,c,d,b,Yang S.X.et al,Ultromicroscopy,2000,应用,Wiener Filter,消除单颗粒像,CTF,像中的信息由与结构相关的部分及噪音组成，则,消除,CTF,后，结构信息部分为,利用多张像，上式改写为,提高分辨率,样品准备,-,包埋,拍照,-low dose,提高信噪比,-s/n ratio,增加像的数量,相位外推（二维晶体）,提高分辨率,-,二维晶体,Ri,R,d,提高分辨率,-,二维晶体,Yang S.X.et al,Chinese Physics,2005,快睡觉了吧,