HPCE高效毛细管电泳理论基础.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第,十一,章高效毛细管电泳分析法,一、,PHCE,基本原理,basic principles of PHCE,二、电渗现象与电渗流,electroosmosis,and,electroosmotic,flow,三、影响电渗流的因素,factors influenced,electroosmosis,四、淌度,mobility,五、,PHCE,中的参数与关系式,parameters and relation in HPCE,六、影响分离效率的因素,factors influenced,separation,efficiency,第二节高效毛细管电泳理论基础,high performance capillary electrophoresis,HPCE,basic theory of HPCE,2025/12/5 周五,一、高效毛细管电泳(,HPCE),基本原理,basic principles of PHCE,电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，,迁移速度与哪些因素有关？,当带电离子以速度,在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。,电场力：,F,E,=,qE,阻 力：,F,=,f,故：,qE,=,f,q,离子所带的有效电荷；,E,电场强度；,离子在电场中的迁移速度；,f,平动摩擦系数(,对于球形离子：,f,=6,；,离子的表观液态动力学半径；,介质的粘度；,),2025/12/5 周五,所以，迁移速度：,（,球形离子,）,物质离子在电场中,差速迁移,是电泳分离的基础。,淌度,：单位电场强度下的平均电泳速度。,2025/12/5 周五,二、电渗现象与电渗流,electroosmosis,and,electroosmotic,flow,1.电渗流现象,当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成,双电层,，二者之间存在电位差。,当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫,电渗现象,。,电渗现象中整体移动着的液体叫,电渗流,（,electroosmotic,flow，,简称,EOF）。,2025/12/5 周五,2.,HPCE,中的电渗现象与电渗流,石英毛细管柱，内充液,pH3,时，表面电离成-,SiO,-,管内壁带负电荷，形成双电层。,在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度,电渗流,。,2025/12/5 周五,3.,HPCE,中电渗流的大小与方向,电渗流的大小用电渗流速度,电渗流,表示，取决于电渗淌度,和电场强度,E,。,即,电渗流,=,E,电渗淌度取决于电泳介质及双电层的,Zeta,电势，即,=,0,0,真空介电常数；,介电常数；,毛细管壁的,Zeta,电势。,电渗流,=,0,E,实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算,电渗流,=,L,ef,/t,eo,L,ef,毛细管有效长度；,t,eo,电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。,2025/12/5 周五,HPCE,中电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：,内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；,内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；,石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；,改变电渗流方向的方法：,（1）毛细管改性,表面键合阳离子基团；,（2）加电渗流反转剂,内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。,2025/12/5 周五,4.,HPCE,中电渗流的流形,电荷均匀分布，整体移动，,电渗流的流动为平流,，,塞式流动,（谱带展宽很小）；,液相色谱中的溶液流动为层流，,抛物线流型,，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。,2025/12/5 周五,5.,HPCE,中电渗流的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；,各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：,+,=,电渗流,+,+,ef,阳离子运动方向与电渗流,一致,；,-,=,电渗流,-,-,ef,阴离子运动方向与电渗流,相反,；,0,=,电渗流,中性粒子运动方向与电渗流一致；,（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；,（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变,LC,中的流速；,（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；,在,HPCE,中，控制电渗流非常重要,。,2025/12/5 周五,三、,HPCE,中影响电渗流的因素,factors influenced,electroosmosis,1.电场强度的影响,电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。,2.毛细管材料的影响,不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；,2025/12/5 周五,3.,电解质溶液性质的影响,（1）溶液,pH,的影响,对于石英毛细管，溶液,pH,增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁,zeta,电势增大，电渗流增大，,pH=7，,达到最大,；,pH3，,完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持,pH,稳定。,（2）阴离子的影响,在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。,缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。,2025/12/5 周五,2025/12/5 周五,4.,温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。,温度变化来自于,“,焦耳热,”,；,焦耳热：,毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；,HPCE,中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。,温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%3%；,2025/12/5 周五,5.,添加剂的影响,（1）加入浓度较大的中性盐，如,K,2,SO,4,，,溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。,（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；,加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。,加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（,SDS），,可以使壁表面负电荷增加，,zeta,电势增大，电渗流增大；,（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。,2025/12/5 周五,四、淌度,mobility,淌度,：,带电离子在单位电场下的迁移速度；,淌度不同是电泳分离的基础。,1.绝对淌度(,absolute mobility),ab,无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。,2.有效淌度,(,effective mobility),ef,实际溶液中的淌度(实验中测定的)。,ef,=,a,i,i,a,i,溶质,i,的解离度,；,i,溶质,i,在解离状态下的绝对淌度,3.表观淌度,ap,离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：,ap,=,ap,E,2025/12/5 周五,五、,HPCE,中的参数与关系式,parameters and relation in HPCE,1.迁移时间（保留时间）,HPCE,兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。,V,外加电压；,L,毛细管总长度；,2.分离效率（塔板数）,在,HPCE,中，仅存在纵向扩散，,2,=2,Dt,扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。,2025/12/5 周五,3.分离度,影响分离度的主要因素；工作电压,V；,毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：,2025/12/5 周五,六、影响分离效率的因素区带展宽,factors influenced the efficiencyband broadening,1.纵向扩散的影响,在,HPCE,中，纵向扩散引起的峰展宽：,2,=2,Dt,由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。,2.进样的影响,当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度,：,W,inj,=(24,D t,),1/2,实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%2%。,2025/12/5 周五,3.焦耳热与温度梯度的影响,电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：,m,电解质溶液的摩尔电导；,I,工作电流：,c,m,电解质浓度；,散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。,改善方法：,（1）减小毛细管内径；,（2）控制散热；,2025/12/5 周五,4.溶质与管壁间的相互作用,存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；,蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大,难题,。,细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。,减小吸附的方法和途径,：加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。,2025/12/5 周五,5.其他影响因素,（1）电分散作用对谱带展宽的影响,当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。,（2）,“,层流,”,现象对谱带展宽的影响,一般情况下，,HPCE,中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；,产生的原因,：毛细管两端液面高度不同。,实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液,平面高度相同,。,2025/12/5 周五,请选择内容,第一节,概述,g,eneralization,第二节,高效毛细管电泳的理论基础,basic theory of HPCE,第三节,高效毛细管电泳仪器,high performance capillary electrophoresis apparatus,第四节,高效毛细管电泳的分离模式,separate types of HPCE,第五节 应用与进展,application and advances of HPCE,结束,2025/12/5 周五,