DNA重组技术的基本工具(上课用)1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题,1,基因工程,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。,让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。,普通棉花抗虫棉,提取目的基因,基因表达载体的构建,目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,1.1 DNA,重组技术的基本工具,基本工具：,限制性核酸内切酶,“,分子手术刀”,DNA,连接酶,“,分子缝合针”,基因进入受体细胞的载体,“,分子运输车”,（一）限制性核酸内切酶,“,分子手术刀,”,来源：,主要从原核生物中分离纯化出来。,种类：,已从近,300,种微生物中分离出,4000,种限制酶。,作用：,1.,能识别双链,DNA,的某种特定核苷酸序列,2.,使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,磷酸二酯键：,T,磷酸二酯键,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,A,具有特异性。,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割,DNA,分子，,作用特点：,大多数限制酶的识别序列由,6,个核苷酸组成,少数的识别序列由,4,、,5,或,8,个核苷酸组成,限制酶的识别序列：,Eco,RI,限制酶的切割：,黏性末端,黏性末端,在,G,与,A,之间切割,大肠杆菌的一种限制酶,(,Eco,R,),只能识别,GAATTC,序列，并在,G,和,A,之间切开。,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的,DNA,两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,C C C G,G G,G G G C C C,中轴线,Sma,I,限制酶的切割：,C C C,G,G G,G,G G,C C C,平末端,平末端,只能识别,CCCGGG,序列，并在,C,和,G,之间切开。,产生黏性末端或平末端。,限制酶的作用结果：,如果把两种来源不同的,DNA,用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性,(,平,),末端，然后让两者的黏性,(,平,),末端黏合起来，就似乎可以合成重组的,DNA,分子了。,思考,?,（二）“分子缝合针”,DNA,连接酶,1,、种类：,Ecoli,DNA,连接酶,T4 DNA,连接酶,2,、作用：,可把黏性末端之间的缝隙,“,缝合,”,起来，,Ecoli,DNA,连接酶或,T,4,DNA,连接酶,即,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,T,4,DNA,连接酶,还可把,平末端之间的缝隙“缝合”,起来，但效率较低,类型：,类型,Ecoli,DNA,连接酶,T,4,DNA,连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T,4,噬菌体,恢复,磷酸,二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端,(,效率较低,),相同点,差别,将外源基因送入受体细胞。,(,三,),基因进入受体细胞的载体,“,分子运输车”,载体的作用：,质粒,噬菌体的衍生物,动植物病毒等,载体的种类：,1.,能够在宿主细胞中,复制并稳定地保存,。,2.,具,多个限制酶切点,，,以便与外源基因连接。,3.,具有某些,标记基因,，便于进行筛选。,4.,对受体细胞无害、容易提取,作为载体的必要条件：,质粒：,裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核,DNA,）之外，并具有自我复制能力的双链环状,DNA,分子。,质粒：,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。,限制酶,DNA,解旋酶,区别,限制性内切酶与,DNA,解旋酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键,将,DNA,两条链的氢键打开形成两条单链,限制酶,DNA,水解酶,区别,限制性内切酶与,DNA,水解酶的区别,切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键，形成片段的,DNA.,切割磷酸二酯键，形成单个的脱氧核苷酸。,比较：,DNA,连接酶与,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,DNA,连接酶,区别,1,区别,2,相同点,1),只能将,单个核苷酸,连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成,磷酸二酯键,1),在,两个,DNA,片段之间,形成磷酸二酯键,2),以,一条,DNA,链为模板,，,将,单个核苷酸,通过磷酸二酯键,连接成一条互补的,DNA,链,2),将,DNA,双链上的,两个缺口同时连接,起来，,不需要模板,相同点：,形成磷酸二酯键,不同点：,1,）,DNA,聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键；而,DNA,连接酶是在两个,DNA,片段之间形成磷酸二酯键,2,）,DNA,聚合酶需要以一条,DNA,链为,模板；而,DNA,连接酶不需要模板。,不是一回事。,1,）不属于质粒被选为基因载体的理由是（）,A,、能复制,B,、有多个限制酶切点,C,、具有标记基因,D,、它是环状,DNA,D,练习,2,）有关基因工程的叙述中，正确的是,（）,A,、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,B,、质粒是基因工程中唯一的载体,C,、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与目的基因连接,D,、,DNA,连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键,C,3.,下列四条,DNA,分子，彼此间具有粘性末端的一组是,A,B,C,D,答案：,D,、关于限制酶的说法中，正确的是（）,A,、限制酶是一种酶，只识别,GAATTC,碱基序列,B,、,EcoRI,切割的是,GA,之间的氢键,C,限制酶一般不切割自身的,DNA,分子，只切割外源,DNA,D,限制酶只存在于原核生物中,答案：,C,.,（多选）,有关基因工程的叙述中，错误的是,A,、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种,B,、重组,DNA,的形成在细胞内完成,C,、目的基因须由运载体导入受体细胞,D,、质粒都可作为运载体,答案：,BD,思考与探究,P7,2,、为什么限制酶不剪切细菌本身的,DNA,？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其,DNA,分子中或者,不具备,这种限制酶的,识别切割序列,，或者通过甲基化酶,将甲基转移,到所,识别序列,的碱基上，使,限制酶不能将其切开,。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的,DNA,被切断，并且可以防止外源,DNA,的入侵。,3,、天然的,DNA,分子可以直接用做,基因工程载体吗？为什么？,提示：,基因工程中作为载体使用的,DNA,分子很多都是质粒（,plasmid,），即独立于细菌拟核处染色体,DNA,之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的,DNA,分子。,是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？,不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,1,）载体,DNA,必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。,2,）载体,DNA,必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体,DNA,上随染色体,DNA,的复制而同步复制。,3,）载体,DNA,必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。,4,）载体,DNA,必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。,5,）载体,DNA,分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,实际上自然存在的质粒,DNA,分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,4,、,DNA,连接酶有连接单链,DNA,的本领吗？,迄今为止，所发现的,DNA,连接酶都,不具有,连接单链,DNA,的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链,DNA,的酶。,DNA,聚合酶,DNA,连接酶,区别,1,区别,2,相同点,DNA,连接酶与,DNA,聚合酶是一回事吗,?,为什么,?,1),只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1),在两个,DNA,片段之间形成磷酸二酯键,2),以一条,DNA,链为模板，,将单个核苷酸通过磷酸二酯键,连接成一条互补的,DNA,链,2),将,DNA,双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,限制酶所识别的序列，无论是,6,个碱基还是,4,个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链,DNA,上的碱基是反向、对称、重复排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,作为载体的必要条件：,有切割位点,供外源,DNA,片段,(,基因,),插入。,能自我复制,有遗传标记基因,供重组,DNA,的鉴定和选择。,载体,DNA,必需是安全的,不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞,外的其他生物细胞中去。,载体,DNA,分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,