医学课件染色质免疫沉淀及其测序.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目录,简介,技术原理,技术流程,应用,优缺点,测序,一、简介,ChIP,是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。,二、原理,染色质免疫沉淀技术（chromatin,immunoprecipitation assay,ChIP）的基本原理是在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和 DNA交联，超声波将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合体，从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。,技术示意图,三、技术流程,具体操作流程,1、甲醛交联细胞,具体步骤,2、染色质超声断裂,1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min。每1min颠倒摇动一次离心管。,2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰上。(不同样本都进行超声条件优化实验),3.14000rpm离心10min(4)，转移上清于1.5ml离心管。,3、免疫沉淀蛋白和DNA复合物,4、收获免疫复合物,（抗体-蛋白质-DNA,）,5、洗脱免疫复合物,6、去除甲醛交联,解交联：加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M).混匀,65,解交联过夜。,7、DNA纯化,1、酚-氯仿抽提,2、硅胶柱纯化,8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定,1.如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列是目的的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定量PCR方法。,2.如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用ChIP克隆测序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法,四、应用,1.组蛋白修饰研究,2.转录调控分析,3.药物开发研究,4.有丝分裂研究,5.DNA损伤与凋亡分析,五、优缺点,优点：充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，可以找出生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。,缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得；为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因获取可能需要限制在组织来源。,注意事项,1、抗体与目的蛋白结合的有效性和特异性,ChIP所选择的目的蛋白的抗体是 ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做 ChIP实验的，只有经过 ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体，只有其他用途的抗体时，可以先做蛋白质免疫沉淀检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白，再进行染色质免疫沉淀实验的检测。,2、交联的条件,交联所用的甲醛终浓度约为 1%，而交联时间需要预实验来确定。通常的交联条件为室温10 min。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。,3、超声片段的大小,打断后的染色质片段的长度应主要集中在200-1000bp 左右。,六、测序,ChIP-Seq的原理是,：,首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。,应用领域,（1）判断 DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；,（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；,（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；,谢谢大家！,