生物化学第一章2.ppt

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acid）,1、蛋白质的结构单位,D-氨基酸：抗生素，生物碱,Tyr,非蛋白质氨基酸,蛋白质基本结构单位：L,氨基酸,氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外,L氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外,氨基酸结构通式：RCH(NH,2,)COOH,常见氨基酸种类：20种。,小结,2、氨基酸分类：,按其侧链,R,的结构和理化性质分类,非极性、疏水氨基酸(非极性R基氨基酸)：,Val,Leu,Ile（支链）；Gly（无旋光异构）；Met（含硫）；Phe（芳香族）；Pro（亚氨基）,极性、中性氨基酸(不带电荷的极性R基氨基酸)：,Ser,Thr（含羟基）；Tyr,Trp（芳香族）；Cys（含硫）；Gln,Asn（含酰氨）,酸性氨基酸（含有两个羧基）：,Glu（含羧基）、Asp（含羧基）,碱性氨基酸（含有两个以上氨基）：,Arg（胍基）、His（咪唑基）、Lys（氨基）,含硫氨基酸：Met、Cys,芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp,三、氨基酸的理化性质,1、物理性质,2、两性解离,等电点（,isoelectric point,pI）：在某一pH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带,净电荷为零,，在电场中不泳动。此时，氨基酸所处环境的,pH值,称为该种氨基酸的等电点(pI)。,甘氨酸的酸碱滴定曲线,(zwitterion),等电点计算,侧链为非极性基团或虽为极性基团但不解离的氨基酸：pI=(pK,1,+pK,2,),酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys：pI=(pK,1,+pK,R,),碱性氨基酸(赖、精、组)：pI=(pK,2,+pK,R,),带电状态判定,pI-pH0 .带正电,pI-pH0 .不带电,等电点的计算,3、紫外吸收：,Trp、Tyr和Phe在280nm波长附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm,氨基酸的化学反应,由,-,氨基参与的反应,1.与亚硝酸的反应：,Van Slyke定氮法,生产上常用于测定蛋白质的水解程度。,氨基酸的化学反应,由,-,氨基参与的反应,2.与甲醛反应：甲醛滴定法,应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定）,A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。,B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。,C.避免氨基的干扰,D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,3.与醛类反应,氨基酸的化学反应,由,-,氨基参与的反应,4.氨基酰化：氨基保护,氨基酸的化学反应,由,-,氨基参与的反应,5.二硝基氟苯：黄色，肽链末端分析,应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸,A.虽然多肽侧链上的-NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与-DNP氨基酸区分和分离,首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构,A.肽分子与DNFB反应，得DNP-肽,B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸,C.分离DNP-氨基酸,D.层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目,氨基酸的化学反应,由,-,氨基参与的反应,6.与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,Edman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽,环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少,一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸,分离PTH-氨基酸,层析法鉴定,Edman降解法的改进方法-DNS-Edman降解法,用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸,原理DNFB法相同,但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定,由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍,可用于微量氨基酸的定量,氨基酸的化学反应,由,-,羧基参与的反应,1.成盐反应,2.成酯反应,氨基酸的化学反应,由,-,羧基参与的反应,3.酰化反应,4.脱羧反应,显色反应：,茚三酮反应,:氨基羧基同时参加反应,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。,加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。,NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,显色反应：,茚三酮反应,茚三酮反应,:脯氨酸，羟脯氨酸，黄色物质,例外：Pro黄色；Asn棕色,成肽反应：,第三节 氨基酸的分离纯化,(,一,),层析技术的原理,俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一,。,一、,层析技术的原理,层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，如水和各种,溶剂,。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。,利用化合物在两种互不相溶（或微溶）的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。,分配层析（萃取的原理）,A、B两个溶液系统、,I（A:B=2:1）1g II（A:B=1:3）1g,第一次萃取后,A中I有2/3g,II有1/4g I:II=8:3（2.6倍）,B中I有1/3g,II有3/4g I:II=4:9（2.15倍）,第二次萃取后,A中I有4/9g,II有1/16g I:II=64:9（7.1倍）,B中I有1/9g,II有9/16g I:II=16:81（5.1倍）,HPLC:,根据,出,峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用,，,可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。,二、电泳法(electrophoresis),概念：带点质点在电场中与本身电荷相反的电极移动的现象。,氨基酸具有两性解离，PH值决定带电情况。,凝胶电泳,等点聚焦电泳,双向凝胶电泳,三、氨基酸的显色反应,第,四,节蛋白质的分子结构,概念,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。,蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。,蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大,一、蛋白质分类,生物体内的作用不同,结构蛋白,功能蛋白：活性蛋白、信息蛋白,分子形状分,球状蛋白,纤维状蛋白,一、蛋白质分类,分子组成成分,1.单纯蛋白,(1)清蛋白、球蛋白：水，甘氨酸,(2)谷蛋白、醇溶蛋白：不溶于水,(3)精蛋白、组蛋白：碱性氨基酸，细胞核,(4)硬蛋白：纤维状蛋白，不溶于水、稀酸稀碱和有机溶剂，含大量胱氨酸,一、蛋白质分类,分子组成成分,1.结合蛋白,(1)核蛋白：核酸,(2)色蛋白：辅基是金属色素,(3)糖蛋白：辅基是糖或者糖的衍生物，所有组织，多种功能,(4)脂蛋白：脂肪类脂结合，与脂质代谢、运输,(5)磷蛋白：辅基磷酸。酯键，丝氨酸，苏氨酸羟基结合。酪蛋白,二、蛋白质结构中的化学键,1.肽键 peptide bond（化学键）,2.二硫键 disuffide bond（化学键）,不同肽链，同一肽链不同部位,半胱氨酸,稳定共价键、稳定肽链空间结构,破坏，蛋白质活性丧失。,角蛋白,二、蛋白质结构中的化学键,3.酯键 ester bond（化学键）,丝氨酸、苏氨酸羟基与氨基酸的羧基,磷蛋白：丝氨酸、苏氨酸羟基,维系蛋白质结构，行使功能,4.离子键 ionic bond（库伦作用）,相反电荷的基团,碱性氨基酸，生理条件下,高浓度盐、过高过低PH,羧基PK低，氨基PK高，1-2个PH单位,二、蛋白质结构中的化学键,5.配位键 dative bond（共价键）,金属离子：Fe,Cu,Mn,Zn,高级结构：锌指结构,螯合剂，蛋白质解离成亚基，变形失活,6.氢键 hydrogen bond,氢原子与两个电负性强的原子（F,O,N）,弱键，供体原子、氢、受体原子处在一条直线,氢供体：=NH,-OH,-NH2,-NH3+,-CONH2,氢受体：-COO-,C=O,二、蛋白质结构中的化学键,7.范德华作用力,原子、基团、分子之间弱相互作用,非专一性的吸引力,取向力、诱导力，色散力,与距离6次方成反比，吸引不相碰,蛋白质内部非极性结构，维系蛋白质高级结构,8.疏水作用hydrophobic bond,非极性侧链（疏水基团）在极性溶剂中为了避开水相互彼此靠近所产生的作用力,本质范德华作用力,蛋白质的内部结构中,次级键介导蛋白质高级结构形成,（一）,、蛋白质的基本结构形式,1、连接方式：,肽键,肽键(peptide bond)：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基缩水而成的酰胺键称为肽键。（CONH）,肽平面(peptide unit)：由肽键中的四个原子和与之相邻的两个碳原子共同构成的刚性平面。（C,CONHC,）,特点：,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。,组成肽键的原子处于同一平面。,在大多数情况下，以反式结构存在。,2、肽分类、命名,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序,通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。,氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：,Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,3、生物活性肽：,谷胱甘肽,神经肽：脑啡肽,(5),、内啡肽,(31-16),、强啡肽,(17,9),、P物质、Y肽,肽类激素：催产素、,胰高血糖素、促肾上腺皮质激素、,加压素等,其他：生长因子；短杆菌,肽,；,青霉素,等,二、蛋白质的一级结构,(primary structure),一级结构是指蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序；主要靠肽键维系。,二四级结构称为蛋白质的空间结构，或空间构象；主要靠次级键维系，尤其是疏水键。,一级结构体现生物信息：20,n,.多样,一级结构是空间结构及生物活性的基础.特异,（一）蛋白质的氨基酸组成,氨基酸组成的种类、含量,蛋白质纯化,蛋白质彻底水解成氨基酸,利用层析技术将氨基酸进行分离,氨基酸定性定量分析,蛋白质氨基酸组成：,残基质量百分数,氨基酸分子数目,例题1：100g胰岛素经过分析苯丙氨酸有8.6g，苯丙氨酸残基质量百分数是多少,（苯丙氨酸相对分子量是147，苯丙氨酸残基165）,8.6X(147/165)=7.7g,例题2：胰岛素的相对分子质量是6000，经过分析丙氨酸占4.6%，请计算胰岛素中有多少个氨基酸残基,（丙氨酸相对分子量是89，丙氨酸残基71）,4.6%X(71/89)=3.66%,6000X3.66%=219,219/71=3,三、二级结构,蛋白质的二级结构是指,多肽链骨架原子,的,相对,空间,位置,，,不涉及侧链,的构象，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，主要有,-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲,。维持二级结构的力量为,氢键,。,构型：不对称化合物中不对称中心上的几个原子或基团的空间排布方式。排列方式改变共价键形成或破坏，与氢键无关。,构象：分子结构中一切原子沿共价单键转动时产生的不同空间排列。不改变共价键，涉及氢键的形成或破坏。,1、,-螺旋,(-helix),血浆蛋白、多肽激素、钙调蛋白、蛋白激酶,角蛋白、肌肉的肌球蛋白，数条-螺旋缠绕，机械强度、弹性,蛋白质表面存在-螺旋，具两性特点,-47-57,1、-螺旋(-helix),右手螺旋：3.6个AA/圈，螺距0.54nm；,每个肽键N-H与第四个肽键的羰基形成氢键,氢键维系：链内氢键（AA,1,AA,4,），平行长轴；,侧链伸出螺旋,S,N：,S为螺旋每圈的残基数，N是形成氢键O与N原子间在主链上的原子数,3.6,13,1、,-螺旋,(-helix),蛋白质中都是右手的，右手比左手稳定,2、-折叠(-pleated sheet),多肽链充分伸展，肽平面折叠成锯齿状；,比,-螺旋,更坚硬,肽键4个原子处于同一平面，-碳原子位于折叠的角上,2、-折叠(-pleated sheet),侧链交错位于锯齿状结构的上下方,，与棱角垂直,2、-折叠(-pleated sheet),氢键维系：氢键的方向垂直长轴；,不同肽链、同一肽链不同肽段，所有肽键参与,可有顺平行片层和反平行片层结构。,2、-折叠(-pleated sheet),顺平行片比反平行片更规则，最适合氢键形成,顺平行片是大结构，大于5个，反平行片可以少到两个,球状蛋白是顺平行反平行都有、纤维状蛋白主要是反平行,3、其它,（1）肽链主链出现的180回折部分称-转角。,由4个连续氨基酸组成，第一个残基的CO与第四个氨基酸的NH形成氢键。,甘氨酸和脯氨酸,-转角在球蛋白中大量存在，约占全部残基的1/4,3、其它,（2）蛋白质分子中那些没有确定规律性的部分肽链构象称为无规卷曲。,影响二级结构形成的因素,四、超二级结构、域结构,1、超二级结构(supersecondary structure),（1）基序或模序（motifs or modules，模体符）,在,一些具有特殊功能的球状,蛋白质中，,由若干,个,相邻的二级结构单元按照一定规律有规则地组合在一起，相互作用，形成在空间构象上可彼此区别的二级结构组合单位,称超二级结构,或,模序。它们可直接作为三级结构的“建筑块”或域结构的组成单位，是蛋白质发挥特定功能的基础。,（2）类型：、锌指结构、亮氨酸拉链,2、域结构（domain，结构域）,域结构是在较大的蛋白质分子中,，一条长的多肽链有时要先分别折叠成几个相对独立的区域，在组装成球状或颗粒状的三级结构。这种自二级或超二级结构基础上形成的特定区域，称为结构域。,短的多肽如果只有1个结构域，结构域与三级结构为同一结构层次,较大蛋白质有多个结构域,2、域结构（domain，结构域）,每个结构域自身是紧密装配的,结构域之间的联系可以松散，可以形成功能域,具有相对独立的空间构象和生物学功能,同一蛋白质中的结构域可以相同,（硫氰酸酶）,或不同,（木瓜蛋白酶）,不同蛋白质中的结构域也可能相同或不同,五、三级结构,蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子的整体空间排布，包括主链和侧链。,是由不同区段上R基相互作用形成的空间构象。,三级结构的形成使得在序列中相隔较远的氨基酸侧链相互靠近。,长度缩短：球形、椭球形、杆状，等,多数同时含有-螺旋和-折叠,氨基酸位置由侧链极性决定：非极性（内）、极性（表面，少数内部）、带电（表面）,次级键维系：疏水键、盐键、氢键、范德华力、二硫键,功能区：表面或特定部位,蛋白质分子中各个亚基的三维空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构,亚基(subunit)：寡聚蛋白中的单条独立的多肽链，具有独立的一、二、三级结构，单独存在时一般无生物学活性。亚基可以相同或不同。,亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华力,亚基可以相同或不同,亚基不一定只有一条链（胰岛素中A链与B链，二硫键连接),六、四级结构,第四节蛋白质结构与功能的关系,蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础，一级结构决定空间结构；但一级结构并非决定空间结构的唯一因素。空间结构是生物活性的直接体现。,1、一级结构中的保守序列决定空间结构,（1）同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构,【经典举例】蛋白变性与复性,一、一级结构与功能的关系,1、一级结构中的保守序列决定空间结构,（2）不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构不同功能,一、一级结构与功能的关系,1、一级结构中的保守序列决定空间结构,（3）保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变,【经典举例】分子病,一、一级结构与功能的关系,2、一级结构并非影响空间结构的唯一因素,分子伴娘(molecular chaperons，分子伴侣)：在蛋白质加工、折叠形成特定空间构象及穿膜进入细胞器的转位过程中起关键作用的一类蛋白质。,The GroEL-GroES-ADP complex crystal structure,2、一级结构并非影响空间结构的唯一因素,分子伴娘,与未折叠的肽段（疏水部分）进行可逆的结合，辅助二硫键的正确形成；,引导肽链的正确折叠并集合多条肽链成为较大的结构；,可以解聚错误聚合的肽段，防止错误发生。,1、空间结构体现生物特异性,2、空间结构体现生物活性,3、空间结构的灵活性，体现了生物活性的可调节特性,二、空间结构与功能的关系,空间结构中的特定区域体现生物活性,肌红蛋白与血红蛋白,别构效应（别位效应、变位效应，,allosteric effect,）：蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从而促使生物学活性变化的现象称为变构效应。包括正协同、负协同效应,【经典举例】血红蛋白（Hb）：由,2,2,四聚体组成，每个亚基含有1个血红素辅基；Hb的氧解离曲线呈“S”型。,多种空间构象，多种活性状态,4、空间构象并非生物活性的唯一影响因素,【举例】低温下酶活性低，但并不影响构象；盐析时沉淀的酶无活性，但构象不变。,5、蛋白构象疾病：,错误构象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。,老年痴呆,疯牛病,亨汀顿舞蹈病,1、蛋白质的变性与复性,去除部分变性剂,温和复性,温和复性,天然蛋白,（具有正确的一级结构和高级结构，因此具有生物活性）,变性蛋白,（具有正确的一级结构但无高级结构，无生物活性）,变性环境,非天然蛋白,（具有正确的一级结构和错误的高级结构，无生物活性）,【经典举例】Rnase,蛋白质的,活性状态与非活性状态,2、前体蛋白与活性蛋白的转变,（切除冗余及其它变化）,前体蛋白,（一级结构冗余，高级结构错误，因此无生物活性）,活性蛋白,（具有正确的一级结构和高级结构，因此具有生物活性）,适合环境,【经典举例】酶原激活：胃蛋白酶原切除N端42个氨基酸后形成活性中心及其他空间构象，转变为具水解蛋白质活性的胃蛋白酶；胰蛋白酶原切除N端6个氨基酸后形成活性中心及其他正确构象，转变为具有水解活性的胰蛋白酶。,蛋白质的,活性状态与非活性状态,3、分子病（,molecular disease,）：由于基因结构改变，蛋白质一级结构中的关键氨基酸发生改变，从而导致蛋白质功能障碍，出现相应的临床症状，这类遗传性疾病称为分子病。,【经典举例】镰形细胞贫血症：编码,血红蛋白,亚基,的结构基因第六个密码子由CTTCAT，相应的多肽序列中N端的第六个氨基酸由GluVla；其空间结构发生相应改变，在表面形成互补区，使蛋白质分子之间彼此聚合，促使红细胞在低氧压下变形成镰形，丧失运输氧的生物活性,。,蛋白质的,活性状态与非活性状态,4、蛋白构象疾病：疯牛病，由于朊病毒蛋白（PrP）构象改变导致蛋白质聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀。,（二级结构及其它变化）,正常动物PrP,c,（,二级结构多为螺旋、对蛋白酶敏感、水溶性,）,致病蛋白PrP,sc,（一级结构相同，但二级结构全为折叠，抗蛋白酶、水溶性差、蛋白聚集成淀粉样沉淀）,未知蛋白,蛋白质的,活性状态与非活性状态,第五节蛋白质的理化性质及分离纯化,1、两性解离与等电点：同“氨基酸两性解离”,2、紫外吸收：最大吸收波长280nm,3、胶体性质：不能透过半透膜,4、沉淀、凝固,蛋白质在溶液中维持稳定的因素：,表面电荷、水化层（溶剂化层）,变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性,一、理化性质,蛋白质的变性作用：,（1）沉淀：,不稳定蛋白质从溶液中析出,（2）结絮：,变性蛋白质,不一定发生沉淀，因为电荷稳定因素未被破坏，当调节PH到等电点，立即结成絮状不溶物的现象。,絮状沉淀可溶于强酸、强碱,（3）凝固：,絮状沉淀,如加热，则变成坚固的凝块，不能再,溶,于强酸、强碱,的现象,（1）变性：,在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。变性不涉及一级结构的变化。,理化性质的变化：紫外吸收、化学活性及粘度上升，易被蛋白酶水解；溶解度下降、结晶能力丧失。,5、变性(denaturation)、复性(renaturation),（2）复性,（3）应用,利用变性：,酒精消毒,高压灭菌,防止变性：低温保存生物制品,取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒),6、呈色反应：双缩尿反应，等,双缩尿反应可检测蛋白质的水解程度,二、蛋白质的分离纯化,（一）根据分子大小不同的分离方法,1.透析：蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放在蒸馏水中，蛋白质溶液中无机盐小分子通过透析袋扩散入纯水中,二、蛋白质的分离纯化,（一）根据分子大小不同的分离方法,2.超过滤：利用外压或离心力使水和其他小分子通过半透膜，蛋白质留在膜上,二、蛋白质的分离纯化,（一）根据分子大小不同的分离方法,3.密度梯度离心,二、蛋白质的分离纯化,（一）根据分子大小不同的分离方法,4.凝胶过滤,二、蛋白质的分离纯化,（二）根据溶解度差异的分离方法,1.等电点沉淀法,蛋白质在等电点时净电荷为零,分子间的静电斥力减少,容易聚集而沉淀,溶解度最小,2.,二、蛋白质的分离纯化,（二）根据溶解度差异的分离方法,二、蛋白质的分离纯化,（三）根据电荷不同的分离方法,二、蛋白质的分离纯化,（三）根据电荷不同的分离方法：离子交换树脂,3.SDS-PAGE,电泳法法测定蛋白质的分子量,在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进,SDS,（十二烷基磺酸钠），,SDS,能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。,蛋白质与,SDS,分子按比例结合，形成带负电荷的,SDS-,蛋白质复合物,，这种复合物由于结合大量的,SDS,，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的,负离子团块,，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于,SDS,与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在,15KD,到,200KD,之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,二、蛋白质的分离纯化,（四）吸附层析,硅胶、氧化铝、活性炭,吸附力的强弱不同,非极性吸附剂：范德华力和疏水相互作用,极性吸附剂:离子键、氢键,二、蛋白质的分离纯化,（五）亲和层析,二、蛋白质的分离纯化,1、透析、超滤,根据性质：分子大小,2、盐析（salting out）,根据性质：蛋白质的沉淀,作用机理：中性盐中和表面电荷，破坏水化层,影响因素：表面电荷、水化层、溶剂性质,3、电泳：,根据性质：蛋白质的两性解离,作用机理：异性电荷互相吸引,影响因素：电荷种类及数量、分子大小及形状、溶液离子强度及pH等,4、层析,（1）离子交换层析：电荷、分子量、分子形状,（2）亲和层析：生物特性,（3）吸附层析：吸附特性,（4）分子筛（凝胶过滤层析）：分子大小及形状,大分子先洗脱下来,5、超速离心：分子大小及形状、溶液特性,第六节蛋白质的结构分析,重要内容：,1、重要名词：,isoelectric point；motifs；domain;subunit；allosteric effect;protein denaturation;molecular disease,2、结构层次,元素组成：C、H、O、N（16%）、S,结构单位：20种L-氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等）,一级结构,：,肽键；多肽链；N端,C端,二级结构：稳定力（氢键）；类型（,螺旋，,折叠，,转角，无规卷曲）,三级结构特点,四级结构特点,3、重要性质：,两性解离及带电状态判定；紫外吸收；沉淀；变性,4、分离纯化：,超滤；盐析；电泳；亲和层析；离子交换层析；分子筛,5、结构与功能关系（举例）,