生物化学21.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,2 蛋白质的结构与功能,2.1,概述,2.2,蛋白质的基本组成单位氨基酸,2.3,蛋白质的结构,2.4,蛋白质结构与功能的关系,2.5,蛋白质的重要性质、分离纯化与,鉴定,2.1,概述,2.1.1 蛋白质的生物学意义和元素组成,2.1.2 蛋白质的分类,2.1.3 蛋白质在生产和生活中的利用,2.1.1 蛋白质的生物学意义和元素组成,2.1.1.1 蛋白质的生物学意义,(1)蛋白质生物学功能的多样性,酶的催化功能、控制生长和分化、代谢调节功能、运动功能、运输作用、免疫保护作用、接受和传递信息、贮存营养功能、结构支持作用,。,（2）蛋白质生物学功能的复杂性,某一功能的发挥往往受到多种因素的影响与调节。,2.1.1.2 蛋白质的元素组成,一般含有：,碳,（5055,）,、,氮,（1518）、,氧,（2023）、,氢,（68）、,硫,（04）。,在某些蛋白质中，还含有一些微量元素如：磷、铁、铜、钼、碘、锌等。,蛋白质元素组成的一个特点：各种蛋白质的氮含量比较恒定，平均值为16左右,。,由于容易用凯氏定氮法进行测定氮的含量，因此，蛋白质的含量可由氮的含量乘以 6.25（100/16）计算出来。,2.1.2 蛋白质的分类,2.1.2.1 根据蛋白质的构象,2.1.2.2 按蛋白质功能分类,2.1.2.3 按蛋白质的组成和溶解性分类,2.1.2.1 根据蛋白质的构象,分为,纤维状蛋白质,和,球状蛋白质,。,球状蛋白质(,globular protein)：,结构特点：,近似于球形或椭圆形，多数可溶于水或盐溶液中。许多具有生理活性的蛋白质如,酶、转运蛋白、蛋白质类激素、免疫球蛋白等均属球状蛋白。,2.1.2.3,按蛋白质的组成和溶解性分类,按组成分为：,简单蛋白质和结合蛋白质。,简单蛋白质：,根据溶解度的不同，又分为,清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、组蛋白、精蛋白、硬蛋白 7 小类,。,结合蛋白质：,根据辅基的不同，可以将结合蛋白质分为：,核蛋白,、,糖蛋白,、,脂蛋白,、,磷蛋白,、,黄素蛋白,、,色蛋白,、,金属蛋白等,。,2.1.3 蛋白质在生产和生活中的利用,2.1.3.1 在食品和饲料领域的应用,2.1.3.2 在医药领域的应用,2.2 蛋白质的基本组成单位,氨基酸,2.2.1 氨基酸的结构,2.2.2 氨基酸的分类,2.2.3 氨基酸的性质,2.2.1 氨基酸的结构,蛋白质中常见的氨基酸有 21 种。除脯氨酸以外，这些天然氨基酸在结构上的共同点是：与羧基相邻的,-,碳原子上都有一个氨基,，,因而称为,-,氨基酸。,脯氨酸的结构式：,2.2.2 氨基酸的分类,2.2.2.1 编码氨基酸,2.2.2.2 非编码氨基酸,2.2.2.3 非蛋白质氨基酸,2.2.2.1 编码氨基酸,硒代-,半胱氨酸(,seleno-cysteine),se-cys,2.2.2.2 非编码氨基酸,蛋白质中有一些不常见的稀有氨基酸，没有相应的三联体遗传密码，故称非编码氨基酸。这些氨基酸都是在生物体合成蛋白质分子后相应的编码氨基酸经羟基化、甲基化、磷酸化等修饰形成的衍生物。,例如：胶原蛋白和弹性蛋白中的,4-羟脯氨酸,和,5-羟赖氨酸,；甲状腺球蛋白中的,二碘酪氨酸,和,L-,甲状腺素,；,-,角蛋白中的,胱氨酸 等,。,2.2.2.3 非蛋白质氨基酸,在生物体内的各种细胞或组织还发现150多种不参与蛋白质组成的氨基酸，故称非蛋白质氨基酸，这类氨基酸多呈游离，但也有结合态的。大部分是蛋白质常见氨基酸衍生物，但也有,D,型和一些,、,或,氨基酸。,这些非蛋白质氨基酸不存在于蛋白质中，多是重要的代谢物前体或代谢中间产物。如瓜氨酸和鸟氨酸是精氨酸的前体，,氨基丁酸是一种神经递质。,2.2.3 氨基酸的性质,构成蛋白质的,氨基酸均为无色晶体，熔点高于200，一般能溶于水、稀酸、稀碱，不溶于有机溶剂，用酒精可把氨基酸从水溶液中沉淀析出。,2.2.3.1 氨基酸的两性解离与等电点,2.2.3.2 氨基酸的光学活性与吸收光谱,2.2.3.1 氨基酸的两性解离及等电点,氨基酸分子既含有酸性的羧基(-,COOH)，,又含有碱性的氨基（-,NH,2,）。,其中的-,COOH,能放出质子（,H,），,而变成-,COO,；,其中的-,NH,2,能接受质子，而变成-,NH,3,。,因此，氨基酸是,两性电解质,（,ampholyte）。,氨基酸两性解离示意图：,氨基酸的等电点：,对某种氨基酸来讲，当溶液在某一特定的,pH,时，氨基酸以,两性离子的形式,存在，正电荷数与负电荷数相等，净电荷为零，在电场中，既不向正极移动，也不向负极移动。这时，溶液的,pH，,称为,该氨基酸的等电点,，用,p,表示。,氨基酸的等电点的作用,：,在一定的实验条件下，等电点是氨基酸的特征常数。当氨基酸处于等电点状态时，其溶解度最小，容易发生沉淀；不同氨基酸，由于,R,基团结构的不同，有不同的等电点。,利用这一特性可以从各种氨基酸的混合物溶液中分离制取某种氨基酸。,（一）氨基酸的构型:,除 甘氨酸 以外，其余 20 种氨基酸的,C,都是不对称碳原子（手性），因而每一种氨基酸都有,D-,型 和,L-,型两种构型。天然蛋白质中的几乎所有的氨基酸都是,L-,型氨基酸。某些微生物和植物体中含有,D-,型氨基酸。,2.2.3.2 氨基酸的光学活性与吸收光谱,甘氨酸的结构式,参与蛋白质组成的氨基酸在,可见光区都没有光吸收,；在,紫外光区,只,有色氨酸、酪氨酸,和,苯丙氨酸,有吸收光的能力。其最大吸收波长(,),分别为280、275、257,nm。,是,利用紫外分光光度计，,在280,nm,波长处，,测定蛋白质浓度的基础。,（二）吸收光谱,2.3 蛋白质的结构,2.3.1 蛋白质的一级结构,2.3.2 蛋白质的三维结构,2.3.1 蛋白质的一级结构,2.3.1.1,肽和肽键,2.3.1.2 天然活性肽,2.3.1.3 一级结构的测定步骤,蛋白质结构层次,蛋白质的一级结构概念,多肽链上各种氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸序列。,2.3.1.1 肽和肽键,一个氨基酸分子的,-,羧基可以与另一个氨基酸分子的,-,氨基缩合，失去一个水分子，从而形成,肽,（,peptide）。,这种由二个氨基酸分子缩合而成的肽，称为二肽（,dipeptide）,。其中，包含一个肽键。,N,H,C,O,C,N,H,C,O,C,OH,H,H,R,1,R,2,H,肽键,（,peptide bone）：,是连接多肽链中氨基酸残基的唯一共价键。,多肽链（,polypeptide chain）,：,由许多氨基酸残基通过肽键彼此连接而成的线状聚合体，称为多肽链,。,氨基酸残基,（,amino acid residue）,多肽链上的每个氨基酸，由于形成肽键而失去了一分子水，成为不完整的分子形式。这种不完整的氨基酸被称为氨基酸残基,。,肽单位平面结构和二面角,（一）肽单位平面结构的特征,肽单位的特征：,1肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转,。,肽键的键长是0.1325,nm，,比,CN,单键（键长0.147,nm）,短些，比,C=N,双键（键长 0.127,nm）,长些。,2肽单位是刚性平面结构。,这就是说，肽单位上的 6 个原子都位于同一个刚性平面上，称为酰胺平面。,3在肽单位上，其,CO,和,NH,都是反式排布。,（二）二面角,（,dihedral angle）,肽平面 1围绕,C,2,N,1,单键旋转，其旋转的角度用,表示；肽平面 2 也可以围绕,C,2,C,2,单键旋转，其旋转的角度用,表示。由于,和,这二个转角决定了相邻二个肽平面在空间上的相对位置，因此，习惯上将这二个转角称为二面角,。,二面角决定多肽链主链骨架的构象。,N1,C,2,C2,2.3.1.2 天然活性肽,谷胱甘肽,脑啡肽,短杆菌肽,S,肽类激素,2.3.1.3 一级结构的测定步骤,测序一般要求样品均一，纯度应在97%以上，允许误差在10%左右。,1.测定蛋白质的分子质量和多肽链的数目,2.拆开蛋白质分子的多肽链,3.断开多肽链内的二硫键,4.分析每一条多肽链的氨基酸组成,5.鉴定多肽链的,N,末端和,C,末端残基,6.把多肽链裂解成两套以上大小不等的较小片段,7.测定各肽段的氨基酸序列,8.重叠各肽段，重建完整多肽链的一级结构顺序,9.确定半胱氨酸残基间形成的,SS,二硫键位置,蛋白质一级结构的表示法,蛋白质的一级结构，通常根据参与组成多肽链,的氨基酸残基种类，按照其排列顺序，,从,N,末端氨,基酸残基开始，依次命名。,举例：甲硫脑啡肽,中文氨基酸残基命名法：,酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甲硫氨酸,三字母符号表示法,：,TyrGlyGlyPheMet,单字母,符号表示法,：,YGGFM,肽键,H,2,N,CO,H,CH,3,S,COOH,NH,C,CO,H,NH,C,CO,H,NH,C,CO,H,NH,C,H,H,CH,2,C,H,CH,2,OH,CH,2,CH,2,2.3.2 蛋白质的三维结构,2.3.2.1,稳定蛋白质构象的作用力,2.3.2.2,蛋白质的二级结构,2.3.2.3,蛋白质的超二级结构和结构域,2.3.2.4,蛋白质的三级结构,2.3.2.5 蛋白质的四级结构,（二）蛋白质的三维结构,蛋白 质的三维结构,指的是蛋白质分子中全部原子和基团相互间的立体关系，包括全部原子和基团的排列、分布及肽链的走向。又称为蛋白质的高级结构、空间结构或构象，可分为,二级,、,超二级,、,结构域,、,三级,和,四级结构,。,2.3.2.1,稳定蛋白质构象的作用力,非共价键,维持，如：,氢键、范德华引力、疏水作用力、离子键。,二硫键、配位键参与维持构象。,2.3.2.2,二级结构,概念：,指多肽链主链在一级结构的基础上，某些肽段借助氢键进一步的盘旋或折叠，从而形成有规律的构象。,维系二级结构的作用力是氢键。,主要类型：,（一）,-,螺旋,（二）,-,折叠片,（三）,-,转角,（四）无规卷曲,（一）,-,螺旋(,-helix),即一个氨基酸残基的,NH,与前面第四个氨基酸残基的,CO,形成氢键。,氢键的取向与螺轴几乎平行。,-,螺旋构象允许所有的肽键都能参与链内氢键的形成。因此，,-,螺旋构象是相当稳定的，是最普遍的螺旋形式。,（二）,-,折叠片,又称为,-,折叠，,二条,-,折叠股平行排布，彼此以氢键相连。,为了在相邻主链骨架之间形成最多的氢键，避免相邻侧链间的空间障碍，各主链骨架同时作一定程度的折叠，从而产生一个折叠的片层。其侧链近似垂直于相邻二个平面的交线，交替地位于片层的两侧。,（三）回折,(,reverse turn),在多肽链中，经常出现180转弯的结构，此结构就是回折。,通常有,-,转角和,-,转角两种形式。,（四）无规卷曲,没有规律性的多肽链主链骨架的构象，就是无规卷曲。,球蛋白分子中，往往含有较多的无规卷曲；无规卷曲,往往,有利于多肽链形成灵活的、具有特异生物活性的构象,。,。,超二级结构的概念,在蛋白质分子结构中经常存在由相邻的二级结构单元（主要是,螺旋和,折叠片）组合在一起，形成有规则的、空间上能够辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件，称为超二级结构。,常见的超二级结构的,组合形式,有,、,等三种组合形式。,另外还有,、C,结构也可见到。,C,中的,C,代表无规卷曲。,2.3.2.3,蛋白质的超二级结构和结构域（1）超二级结构,（2）结构域,概念,多肽链在二级结构的基础上，进一步卷曲折叠成为相对独立、近似球形的松散连接的三维实体。是三级结构的局部折叠区。,结构域这一层次的发现，与蛋白质的功能是分不开的。很多结构蛋白的活性中心都位于结构域之间，由于结构域之间常常只有一段肽链相连，形成所谓“铰链区”（,hinge region），,使结构域容易发生相对运动。,结构域之间的这种柔性（,flexibility）,有利于如酶和抗体活性的发挥。,2.3.2.4,三级结构,（,tertiary structure）,概念：,多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成特定的球状分子结构，称作三级结构,。,或者说三级结构是指多肽链中所有原子的空间排布。,2.3.2.5 四级结构,概念：,由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合而成的有特定三维结构的蛋白质构象称为蛋白质的四级结构,。,四级结构中所含的每个具有三级结构的球状蛋白质称为亚基（,subunit）,或单体（,monomer），,游离的亚基无生物活性。,四级结构涉及亚基的种类和数目以及各亚基在整个分子中的空间排布，包括亚基间的接触位点和相互作用关系，而不包括亚基本身的构象。,由少数亚基聚合而成的蛋白质，称为寡聚蛋白（,Oligomer protein），,根据亚基数目的不同，可以将寡聚蛋白分为二聚体、三聚体、四聚体等，根据亚基种类的不同，可以分别以,、,、,命名不同的亚基。由几十个，甚至于上千个亚基聚合而成的蛋白质，称为多聚蛋白（,polymer protein）。,烟草花叶病毒示意图：,烟草花叶病毒的外壳蛋白四级结构：亚基呈螺旋状排布。,蛋白质的结构层次,一级结构(,primary structure)；,二级结构（,secondary structure）；,超二级结构（,supersecondary structure）；,结构域（,structural domain）；,三级结构（,tertiary structure）；,四级结构（,quarternary structure）,蛋白质结构层次：,2.4 多肽、蛋白质的结构与功能的关系,2.4.1蛋白质一级结构与功能的关系,2.4.2 蛋白质构象与功能的关系,2.4.1蛋白质一级结构与功能的关系,2.4.1.1,一级结构与同源蛋白质的物种差异,和生物进化,2.4.1.2,一级结构变异与分子病,2.4.1.3,一级结构断裂与功能激活,2.4.1.1,一级结构与同源蛋白质的物种 差异和生物进化,在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称,同功能蛋白质,，它们的氨基酸序列具有明显的相似性，这种现象称为序列同源，有明显序列同源的蛋白质也称,同源蛋白质,。,从不同物种提取得到的同源蛋白质中许多的氨基酸残基是完全相同的，称,不变残基,，它们决定了蛋白质的空间结构与功能。而其它氨基酸残基有相当大的变化，称为,可变残基,，它们的差异体现了种属特异性。,因此，对不同生物来源的同功能蛋白质的一级结构进行比较研究：,1.可以帮助我们了解哪些氨基酸对蛋白质的活,性是重要的，哪些是不重要的。,2.可为生物进化提供新的可靠依据。,不同生物来源的细胞色素,C,一级结构比较,对 50 多种不同生物来源的细胞色素,C,的一级结构的,104,个氨基酸进行比较，发现 35 个氨基酸在各种生物中是保守的。,2.4.1.2,一级结构变异与分子病,分子病是由于基因突变导致蛋白质一级结构突变，使蛋白质功能下降或丧失，而产生的疾病被称为分子病。,镰刀型红细胞贫血病,由,血红蛋白分子,亚基,N,末端序列的一级结构改变引起的。,正常红细胞和镰刀状红细胞的扫描电镜图谱,？,2.4.1.3 一级结构断裂与功能激活,许多具有一定功能的蛋白质，在动物体内通常以无活性的,前体形式,产生和贮存。它们这些前体在机体需要时，经过某种蛋白酶的限制性水解，切去部分肽段之后，才变成有活性的蛋白质。,如参与蛋白质消化的各种蛋白酶、参与血液凝固的血纤维蛋白、凝血酶和凝血因子，参与代谢调节的激素蛋白等。,激活（,activation）：,使前体变成活性蛋白质的过程，被称为激活,。,2.4.2 蛋白质构象与功能的关系,蛋白质分子的生物功能直接由其特定构象所决定，空间结构的变化必然引起功能改变。,变构调节活性,有些蛋白质在完成其生物功能时空间结构往往发生一定变化，改变分子的性质，以适应生理功能的需要，称,变构或别构作用,。血红蛋白有两种构象，一种是对氧亲和力低的,T,态，另一种为对氧亲和力高的,R,态。,变性丧失活性,维系其高级结构的次级键体系可能被扰乱。,血红蛋白,-,亚基,-,亚基,（,-,subunit）,血红素,（,haem,）,血红蛋白的变构现象,（变构时的亚基移动）,血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线不同，前者是,S,形曲线，后者是双曲线。,-,亚基可与氧结合，而,-,亚基由于存在空间位阻，几乎不与氧结合。当,-,亚基与氧结合后，发生三级结构的变化，此变化使相邻的,-,亚基发生三级结构的变化，与氧结合使血红蛋白结合氧的能力在短时间内迅速上升，从，而使,曲线程,S,形。,氧饱和度（,%,）,2.5.1 蛋白质的重要性质,2.5.2 蛋白质分离纯化的原则与方法,2.5 蛋白质的重要性质、分离纯化与鉴定,2.5.1.1,蛋白质的两性解离与等电点,2.5.1.2,蛋白质的胶体性质与沉淀,2.5.1.3,蛋白质的变性与复性,2.5.1.4蛋白质的呈色反应,2.5.1 蛋白质的重要性质,2.5.1.1,蛋白质的两性解离与等电点,在蛋白质分子中，有许多可解离的基团，除了肽链末端的,-,氨基和,-,羧基以外，还有各种侧链基，如：,Asp,和,Glu,的侧链羧基，,Lys,的,-,氨基、,Arg,的胍基、,His,的咪唑基、,Cys,的巯基、,Tyr,的酚基。因此，蛋白质是多价的两性电解质。,蛋白质的等电点,（,isoelectricpoint）,概念：,当溶液在某个,pH,时，使蛋白质分子所带正电荷数与负电荷数恰好相等，即净电荷为零，在直流电场中，既不向阳极移动，也不向阴极移动，此时，溶液的,pH,就是该蛋白质的等电点,，,用,pI,表示。,在等电点时，蛋白质比较稳定，溶解度最小。因此，可以利用蛋白质的等电点来分别沉淀不同的蛋白质，从而将不同的蛋白质分离开来。不同的蛋白质有不同的等电点。,2.5.1.2,蛋白质的胶体性质与沉淀,（一）蛋白质的胶体性质,球蛋白溶液具有亲水胶体的性质。这种亲水胶体溶液是比较稳定的。其稳定因素有两个：,（1）球状大分子表面的水化层；,（2）球状大分子表面具有相同的电荷，由于同性,电荷的相互排斥，使得大分子不能互相结合,成较大的颗粒。,盐溶,盐析,蛋白质的沉淀方法,1盐析,2加酸或碱沉淀蛋白质,3有机溶剂沉淀蛋白质,4重金属盐沉淀蛋白质,5生物碱试剂沉淀蛋白质,6抗体对蛋白质抗原的沉淀,2.5.1.3 蛋白质变性与复性,（一）蛋白质变性,定义：,天然蛋白质在变性因素作用之下，其一级结构保持不变，但其高级结构发生了异常的变化，即由天然态（折叠态）变成了变性态（伸展态），从而引起了生物功能的丧失，它的物理、化学性质也发生改变。这种现象被称为变性（,denaturation）。,引起变性因素：,物理因素和化学因素。,变性表现：,1物理性质的改变：,溶解度,2化学性质的改变：,易被蛋白酶消化,3生物功能的改变,变性机理：破坏了蛋白质分子构象中的次级键。使原来埋藏在分子内部的疏水集团大量暴露出来，使分子表面水化膜破坏，分子结合沉淀。,（二）复性（,renaturation）,蛋白质的变性有可逆变性和不可逆变性之分。可逆变性在除去变性因素之后，在适宜的条件下，变性的蛋白质可以从伸展态恢复到折叠态，并恢复全部的生物活性。这种现象，称之为复性,。,2.5.1.4蛋白质的呈色反应,蛋白质分子的自由 一,NH,2,基和 一,COOH,基、肽键，以及某些氨基酸的侧链基团，如：,Tyr,的酚基、,Phe,和,Tyr,的苯环、,Trp,的吲哚基、以及,Arg,的胍基等，能够与某种化学试剂发生反应，产生有色物质。,2.5.2 蛋白质分离纯化的方法,1.前处理,2.沉淀分离,3.分离纯化,4.质量鉴定,1前处理,选择适当的生物材料，加上适当的抽提试剂，如 0.1,molL NaCl,溶液，采用适当的细胞破碎方法，对生物材料进行细胞破碎，使蛋白质充分释放到溶液中。然后离心，除去沉淀，得到上清液。,2.沉淀分离,采用适当的沉淀法，从抽提液中分离目的蛋白。如硫酸铵分段盐析法、乙醇分段沉淀法、等电点沉淀法、选择性变性法等。,3分离纯化,柱层析法、制备性电泳法、蔗糖密度梯度和等电聚焦电泳等、结晶法等。,在提纯过程中，必须时刻注意防止蛋白质变性。因此，必须低温（04）操作，防止过酸过碱、防止产生过多的泡沫等。,4质量鉴定,1.纯度的鉴定。,鉴定蛋白质制剂纯度的方法很多，有聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超离心沉降法、免疫电泳法、酶活力法等。一般需要用二种或更多种方法鉴定蛋白质制剂的纯度。,2.生理活性的鉴定,。,蛋白质的生理活性，如酶的比活力，多肽激素的生理活性等。为了计算酶的比活力，还必须测定蛋白质浓度。测定蛋白质浓度可以采用福林,酚法、双缩脲法等。,