第六章人工染色体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 人工染色体,生物体的许多重要性状牵涉到复杂的生理生化反应系列，受多基因或基因簇的控制，与成百至上万千碱基的,DNA,片段相关。,复杂基因组的物理作图和基因的定位克隆也涉及到大片段,DNA,的研究。,因此，,提高载体的容纳量,一直是克隆载体的重要发展方向之一。,随着脉冲电泳技术的发展以及基因组研究的日益深入，对可插入大片段,DNA,的克隆载体,人工染色体,的研究取得了迅速的发展,所谓人工染色体,是一类能在生物细胞中独立,“,稳定存在和遗传的人工重组,DNA,分子,”,。,酵母人工染色体载体（,yeast artificial chromosome,YAC,，,1000kb,）,细菌人工染色体（,bacterial artificial chromosome,BAC,，,300kb,）,哺乳类人工染色体（,MAC）,P1,衍生人工染色体,现正在研究的人工染色体,总结,一、,YAC,的基本序列元件,酵母染色体,DNA,自主复制顺序（,ARS）,酵母染色体的,着丝粒顺序（,CEN）,酵母染色体的,端粒顺序（,TEL）,第一节,YAC,酵母人工染色体,YAC,载体主要是用来构建大片段,DNA,文库，特别用来,构建高等真核生物的基因组文库,，并不用作常规的基因克隆。,正常酵母人工染色体含有：,*四膜虫端粒（,tel,）,定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的,DNA,不被胞内的核酸酶降解，形成稳定的结构,YAC,载体的选择标记,主要采用营养缺陷型基因,TRP 1,：色氨酸生物合成基因缺陷型,URA 3,：尿嘧啶生物合成基因缺陷型,LEU 2,：亮氨酸合成基因缺陷型,SUP,4,：赭石突变抑制基因,作用方式：,YAC,载体配套工作的宿主酵母菌（如,AB1380,）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变,ade,2-1,。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因,sup,4,的载体存在于细胞中时，可抑制,ade,2-1,基因的突变效应，形成正常的白色菌落。,由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备,YAC,载体，,YAC,载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。,二、克隆策略,YAC,克隆,DNA,片段的过程是：目的基因在限制性内切酶酶解后变成大片段,DNA,，克隆进酵母载体,DNA,，转染酵母缩主细胞，扩增后，根据标记性状筛选出重组的人工染色体,三、,YAC,克隆系统的特点,1,、,YAC,作为可提供大片段,DNA,的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程（200500,kb，,甚至1000,kb）,2、用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的,YAC,变成一个大的,YAC,3、酵母作为一种真核生物，为其它真核的,DNA,提供了更合适的环境,四、,YAC,克隆系统的,缺点,首先，在,YAC,载体的插入片段会出现缺失（,deletion,）和基因重排（,rearrangement,）的现象。,其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个,YAC,中的插入片段由,2,个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的,5%,50%,。,YAC,染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了,YAC,载体的广泛应用。,YAC,染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。,返回,第二节 细菌人工染色体（,BAC）,一、,BAC,特点,1,、,是以大肠杆菌的,F,因子的重要位点及基因为主体的,高通量低拷贝,的质粒载体。,2,、,F,因子的特点,又称致育因子，是一个100,kb,的质粒，能整合到宿主染色体中。并能高频率的转移遗传标记。,F,因子在大肠杆菌中的复制受到严格控制而保持低拷贝，一般为每细胞,1,2,个拷贝，其,parB,基因能够排斥细胞中的外源性,F,质粒，限制了细胞内质粒分子间的重排，降低了,BAC,中外源基因的重组和嵌合度,带有外源片段的,BAC,载体在细菌细胞（,重组缺陷型，,rec,）,中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持,DNA,大分子在细胞内稳定复制而不发生重组，尤其是重复序列多的,DNA,大分子,克隆350,kb,F,因子具有携带,1Mb,插入片段的潜能，这就使构建具有大容量克隆能力的载体成为可能,将,F,因子经基因工程改良构成的,BAC,载体，可用于克隆,100 kb,以上的,DNA,片段。,二、,BAC,载体的结构,1992年,Shizuya,利用,F,因子的复制起点和氯霉素抗性标记基因，在,F,质粒（,pMBO131,）,基础上构建了第一代,BAC,人工染色体。能够克隆和保持大于,100kb,的,DNA,。,新一代,BAC,载体为7.4,kb,的环状质粒：,F,因子的,parA，parB，parC,基因以保证低拷贝的,BAC,质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞,oriS,基因：来源于大肠杆菌,F,因子（致育因子）的严谨型控制的复制子,解旋酶基因,repE,：一个易于,DNA,复制的由,ATP,驱动的解旋酶,选择标志基因,Cm,r,氯霉素抗性基因,cosN,来源于,phage,的,cos,位点，可以用,末端酶切割,BAC,使之线性化,Not,识别序列，位点十分稀少。重组子通过,Not,消化后，可以得到完整的插入片段。,lacZ,基因颜色鉴别重组子，外源基因插入,Cre/loxP,：来自,P1,噬菌体，,Cre,重组酶基因和,loxP,序列位于,P1,噬菌体基因组内，,loxP,是,Cre,酶的识别序列,用相应的酶作不完全酶切，可以获得长度不等的,DNA,片段,人工合成的进行末端标记的含有,loxP,序列的片段,Cre,酶识别,loxP,位点后形成的线性化的,BAC DNA,经,PFGE,电泳后进行放射自显影，含有标记的,loxP,序列的片段会有条带,利用,Cre/loxP,直接构建外源基因的限制酶谱,三、,BAC,优点,BAC,载体的容载能力一般为,100,350kb,以大肠杆菌为寄主，转化率高，构建文库比文库更容易,载体以环型超螺旋状态存在，,BAC,载体空载时大小约,7.5kb,，在大肠杆菌中以质粒的形式复制，具有一个氯霉素抗性基因。,外源基因组,DNA,片段可以通过酶切、连接克隆到,BAC,载体多克隆位点上，通过电穿孔的方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株。装载外源,DNA,后的重组质粒通过氯霉素抗性和,Lac Z,基因的,互补筛选。,的复制子来源于因子，可稳定遗传，嵌合及重组现象少,可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便快捷,载体在克隆位点的两侧具有,7,和,6,聚合酶启动子，可以用于转录获得探针或直接用于插入片段的末端测序,返回,P1,噬菌体与,噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（,110,115kb,）线性,DNA,，并在体外包装于,P1,壳内。,P1,进入宿主细胞后环化，扩增。,1994,年，有人将,P1,和,F,因子克隆结合产生,P1,人工染色体克隆系统,-PAC,。,第三节 其他的人工染色体,一、,P1,人工染色体克隆系统,-PAC,基于,PAC,的人类基因组文库插入片段的大小在,60kb,150kb,之间。,二、人类人工染色体,返回,1,、自上而下的策略该策略：是以天然染色体的断裂片段为基础，构建新的,HAC,这些断裂片段主要通过以下方法得到,(,),低剂量辐射,(,),端粒定位染色体截断技术,(,),外源性片段定点插入后扩增,(,),天然染色体有丝分裂过程中自发形成,将外源性端粒整合入哺乳动物染色体,可将该染色体截断,同时在断端产生新的端粒。研究者们应用这种技术修剪哺乳动物染色体，成功构建了一系列大小在,0.5,6,之间不等。最初，端粒整合的位点是随机的，而现在，研究者们能够将端粒定点插入染色体中特定的位点。,（,2,）自下而上的策略,该策略是在细胞内或者细胞外将着丝粒、端粒以及复制起点装配在一起，从而构建,HAC,。,研究者应用这种策略，在,1080,细胞中得到了第一种。,他们将,1,的人,17,号染色体的,卫星、人端粒、人基因组随机片段用脂质体共转染,1080,细胞。,经过重组，那些同时含有着丝粒、端粒、复制起点且按照正常染色体结构顺序的重组连接产物以染色体的形式稳定保存下来，而那些不完整或未按照正常顺序连接的产物因其不能稳定地进行有丝分裂而丢失、降解。由此通过有丝分裂而自然筛选出。,质粒,受体细胞,结构,插入片断,举例,E.coli,环状,8kb,p,UC,18/19,T-,载体,pGEM-3z,等,噬菌体,E.coli,线状,9-24kb,EMBL,系列，,gt,系列,丝状噬菌体及噬菌粒,E.coli,环状,10 kb,M13mp,系列,粘粒载体,E.coli,环状,35-45kb,pJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCV,BAC(Bacterial Artificial Chro,mo,some),E.coli,环状,300 kb,Pel oBAC,系列,PAC(P1-derived Artificial chromosome),E.coli,环状,100-2000 kb,PCYPAC1,YAC(Yeast Artificial chromosome),酵母细胞,线性染色体,100-1000 kb,MAC(Mammalian Artificial Chromosome),哺乳类细胞,线性染色体,1000 kb,病毒载体,动物细胞,环状,SV40,载体，昆虫,杆状病毒载体,穿梭载体,动物细胞,和细菌,环状,pSVK3,质粒，,PBV,Ti,质粒,载体的种类和特征,