第四讲免疫血清学技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫血清学技术,用于检测抗原或抗体的体外免疫反应技术或称免疫检测技术，这一类技术因一般都需用血清进行试验，通常称为免疫血清学反应或免疫血清学技术,第,四,讲,一、凝聚性试验,抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质存在下，相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或沉淀物，根据是否产生凝聚现象来判定相应抗体或抗原，称为凝聚性试验,根据参与反应的抗原性质不同，分为由,颗粒性,抗原参与的,凝集试验,和由,可溶性,抗原参与的,沉淀试验,二大类,（一）凝集试验,细菌、红细胞等,颗粒性抗原,，与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验(,agglutination test)。,参与凝集试验的抗体主要为,IgG、IgM,。,凝集试验可用于检测抗原或抗体。,凝集试验可根据抗原的性质、反应的方式分为,直接凝集试验,（简称凝集试验）和,间接凝集试验,。,直接凝集试验,颗粒性抗原,与,凝集素,直接结合并出现凝集现象的试验称作直接凝集试验(,direct agglutination test),玻片法：定性试验，适用于新分离细菌的鉴定或分型,试管法：定量试验，检测待测血清中是否存在相应抗体和测定抗体含量,间接凝集试验,将,可溶性抗原(或抗体),先吸附于一种与免疫无关的，一定大小的,不溶性颗粒,(统称为,载体颗粒,)的表面，然后与相应抗体(或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝集反应称为间接凝集反应。,敏感性高，但特异性较差,间接血凝试验,将抗原致敏于红细胞表面，用以检测相应抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集，称为,间接血凝试验,(,passive,heamagglutination,assay,PHA),将抗体致敏于红细胞表面，用以检测检样本中相应抗原，致敏红细胞在与相应抗原反应时发生凝集，称为,反向间接血凝试验,(,reverse passive,heamagglutination,assay,RPHA)。,乳胶凝集试验,聚苯乙烯乳胶是利用化工原料聚苯乙稀经过乳液聚合得到的高分子乳胶液，乳胶微球直径约0.8,m。,对蛋白质、核酸等高分子物质具有良好的吸附性能。,利用聚苯乙烯乳胶的微球作载体，以吸附某些抗原(或抗体)，即能用以检测相应的抗体(或抗原)，称为乳胶凝集反应。(,latex agglutination test),协同凝集试验,葡萄球菌,A,蛋白(,staphylococal protein A，,简称,SPA),是大多数金黄色葡萄球菌的特异性表面抗原，能与多种哺乳动物,IgG,分子的,Fc,片结合。,SPA,与,IgG,结合后，其,Fab,片暴露于外，并保持其抗体活性。,当此被覆着特异性抗体的葡萄球菌与相应的抗原结合时，就可互相连结引起协同凝集反应，简称,COAG。,（二）沉淀试验,可溶性抗原(如,细菌,的外毒素、内毒素、菌体裂解液，,病毒,的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验(,precipitation test)。,抗原可以是,多糖、蛋白质、类脂,等，抗原分子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结合的总面积大，故在作定量试验时，为了不使过剩，,通常稀释抗原,，并以抗原稀释度作为沉淀试验效价。,参加沉淀试验的抗原称,沉淀原,，抗体称为,沉淀素,。,环状沉淀试验,在小口径试管内先加入已知抗血清，然后小心沿管壁加入待检抗原于血清表面，使之成为分界清晰的两层,数分钟后，两层液面交界处出现,白色环状沉淀,，即为阳性反应。,本法主要用于抗原的定性试验，如炭疽病的诊断(,Ascoli,试验,)。试验时出现白色沉淀带的最高抗原稀释倍数，即为血清的沉淀价。,琼脂免疫扩散试验,琼脂的作用,抗原抗体在琼脂凝胶中扩散，当二者在比例适当处相遇，即发生沉淀反应，形成肉眼可见的沉淀带，此种反应称为琼脂免疫扩散，又简称琼脂扩散和免疫扩散。,单向单扩散 单向双扩散,双向单扩散 双向双扩散,免疫电泳技术,免疫电泳,对流免疫电泳,火箭免疫电泳,二、标记抗体技术,抗体、抗原分子小，在含量低时形成的抗原抗体复合物是不可见的。,将特殊物质标记在抗体分子上，通过检测标记分子来显示抗原抗体复合物的存在，即根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称为,标记抗体技术,(,labelled antibody technique)。,高敏感性的标记分子,荧光素,酶分子,放射性同位素,荧光抗体技术,酶标抗体技术,同位素标记技术,（一）荧光抗体标记技术,fluorescent-labelled antibody technique,是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。,荧光色素,是能够产生明显荧光，并能作为染料使用的有机化学物称为荧光色素或荧光染料。,可用于标记的荧光素有,异硫氰酸荧光素(,FITC),、,四乙基罗丹明(,RB 200),和四甲基异硫氰酸罗丹明(,TRITC),染色原理及方法,FITC,含有异硫氰基，能与,IgG,分子自由基结合，形成,FITC-IgG,复合物，且不影响结合抗原的能力和特异性，因此，当荧光抗体与抗原结合后形成有荧光性的抗原抗体复合物,常用直接法与间接法,将,SPA,标记,FITC,制成,FITC-SPA,（二）酶标抗体技术,根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立起来的免疫检测技术。,基本程序：标记抗原抗体复合物底物,根据底物溶液的颜色反应来判定有无相应的免疫反应。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。,用于标记的酶,用于标记的酶有辣根过氧化物酶(,Horseradish peroxidase，,HRP,)、,葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶,HRP,的作用底物为过氧化氢，催化时可使供氢体产生一定颜色,邻苯二胺(,OPD)，,显色呈橙色，,492nm,四甲基联苯胺（,TMB），,显色呈蓝色，,450,或,650nm,3，3二氨基联苯胺(,DAB)。,反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物。,酶联免疫吸附试验,(,ELISA),ELISA,是当前应用最广、发展最快的一项新技术。其基本过程是将抗原(或抗体)吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。,固相载体,：聚苯乙烯微量滴定板（珠），硝纤膜,包被,：牢固的吸附在载体表面，保持免疫原性,可溶性物质或蛋白质抗原易包被,较大的病毒、细菌需打碎或提取抗原,用于包被的抗原或抗体需要纯化,包被的蛋白质浓度通常为110,ug/ml,0.1mol/L pH9.6,碳酸盐缓冲液包被,4,过夜或,372,3h,，,4,或,-20,保存,ELISA,实验中的影响因素,洗涤,：,PBST,试验方法,ELISA,的核心是利用抗原抗体的特异性吸附，在固相载体上一层层地叠加,底物显色,结果判定,试验方法主要有以下几种,BA-ELISA:,抗原、待检血清、生物素化的二抗、酶标生物素,BAB-ELISA:,抗原、待检血清、生物素化的二抗、亲和素、酶标生物素,ABC-ELISA:,抗原、待检血清、生物素化的二抗、酶标记亲和素与生物素复合物,Dot-ELISA,免疫组化染色技术,标本制备和处理：组织切片、压片、涂片、细胞盖片；消除内源性过氧化酶,染色：间接法、直接法,显色,观察,（三）放射免疫测定,（,RIA,）,将同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反应的高度特异性结合起来而建立的免疫分析技术,可定量分析，也可定性分析,特异性强、灵敏度高、准确性和精密度好,三、中和试验,根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验称为中和试验。,主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清的质量评价和检测动物血清中的抗体等。,中和试验分为2种,终点法中和试验(,endpoint neutralization test),固定病毒稀释血清法：测定病毒毒价；固定病毒稀释血清接种细胞或动物，计算中和价,固定血清稀释病毒法：固定血清稀释病毒接种细胞或动物，计算,LD50,，然后计算中和指数（中和组,LD50/,对照组,LD50,）,空斑减少试验(,plague reduction test),：空斑数减少,50,的血清量作为中和滴度,病毒稀释成每一接种剂量含,100PFU,，加倍比稀释的血清，,37 1h,接种细胞,加入预温的营养琼脂,计算空斑数,四、其他检测技术,免疫转印技术（,immunoblotting）,免疫沉淀（,immunoprecipitation）,化学发光免疫测定（,chemiluminescent immunoassay，CLIA）,胶体金免疫检测技术,免疫血清学技术的应用,动物疫病的诊断,微生物的鉴定,免疫增强药物和疫苗研究,生物活性物质超微定量,