细胞工程-6细胞融合.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,第四章 细胞融合,一、概述,二、细胞融合的,发现和发展,三、细胞融合的意义,四、自发融合,五、细胞融合的机理,六、诱导融合,七、体细胞杂种的遗传,八、展望,一、概述,细胞融合（,cell fusion,）：,是两个或更多细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。,二、细胞融合的,发现和发展,1938,年，,Muller,首次发现了体细胞间的融合现象,脊椎动物肿瘤细胞的多核现象。其后科学家们相继在肺结核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。,1875,年，科学家们在蛙的血细胞中也看到了多核细胞的现象，但是当时科学发展水平的限制，没有给予足够重视。,在细胞体外培养技术出现后，,Lambert,首次报道体外培养的肿瘤细胞有,10,-2,10,-6,自发融合概率。,1960,年，法国的,Barski,等首先发现，两种不同类型的细胞在混合培养的过程中会自发融合形成融合细胞。,1962,年日本学者,Okada,发现一种日本血细胞凝集病毒,(HVJ),能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。在此基础上，用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间的杂交细胞。,以后人工诱导体细胞融合逐渐成为一门技术发展起来，建立了更有效的融合和选择杂交细胞的方法。广泛应用于种间、属间、科间，乃至动植物细胞间的融合，从而发展成为一门无论在生物学的基础理论研究，或在医学、生物工程的应用研究方面均具广阔前景的细胞工程技术。,三、细胞融合的意义,肌管的形成,巨细胞,五、细胞融合的机理,细胞融合实际上包括多个,过程,：首先是两个亲本细胞并列，细胞膜相接触，以后膜局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。,融合细胞表现的,特征性变化,：出现膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。,Singer and Nicolsons Model of membrane structure:,The fluid-mosaic model is the“central dogma”of membrane biology.,The core lipid,bilayer,exists in a fluid state,capable of dynamic movement.,Membrane proteins form a mosaic of particles penetrating the lipid to varying degrees.,The Fluid Mosaic Model,proposed in 1972 by Singer and Nicolson,had two key features,both implied in its name.,An Overview of membrane functions,1.,Define the boundaries of the cell and its organelles.,2.,Serve as loci for specific functions.,3.,provide for and regulate transport processes.,4.,contain the receptors needed to detect external signals.,5.,provide mechanisms for cell-to-cell contact,communication and adhesion,融合过程中两个细胞膜的变化过程,类脂质分子发生扰动和重排,导致细胞桥的形成,细胞质、核相互融合,在离体的条件下，采用生物、化学或是物理的方法促使两个或多个细胞融合，形成一个杂种细胞的过程。,目前诱导融合广泛进行的是体细胞的融合,融合的结果是产生一个杂交细胞（hybrid，也有称之为杂种细胞），所以体细胞的融合也称之为体细胞杂交（somatic hybridization）。,六、诱导融合（induced cell fusion）,（一）诱发细胞融合的方法,（二）融合细胞的筛选,（三）融合细胞的克隆化,（四）融合细胞的应用,（一）诱发细胞融合的方法,1.病毒诱导细胞融合,2.化学融合剂诱发细胞融合,3.电融合,1.病毒诱导的融合,病毒类是研究的最早的促融剂，一些致癌、致病病毒如疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等，都能诱导细胞融合，但由于毒性大，应用上收到很大限制。,仙台病毒（HVJ）是一类被膜病毒，属于副黏液病毒，又称副流感病毒1或日本凝血病毒。圆球形，由RNA、衣壳和囊膜组成。病毒被膜含有糖蛋白，其表面还布有许多神经氨酸酶（唾液酸酶）和凝血活性的突起。,诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的RNA，而是,它的外膜,。,那么？,HN蛋白具有识别唾液酸受体的能力，当HN蛋白与细胞表面的唾液酸受体结合后，复合物结构发生变化。F蛋白插入靶细胞中，促使膜融合。同时释放融合缩氨酸进入细胞，诱导细胞融合。,灭活后的病毒颗粒结合到细胞表面。两受体细胞开始凝聚。,两细胞的膜紧密结合。病毒被膜与受体细胞的浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜，产生破口，在两细胞间形成细胞质通道（37、1-2min），通道继续扩大，病毒颗粒流入细胞质内，细胞质互相融合。,融合细胞变圆，融合结束。,每一细胞必须有足够数量的病毒颗粒附在细胞膜上，细胞才能凝集。,凝集要在4 中进行，几分钟内可见细胞聚集成小团。,融合要在较高温度中进行，一般为37。,2.化学融合剂诱发细胞融合,它们主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、甘油醋酸酯、油酸、油胺和二价阳离子载体等。其中则以,PEG,的使用最为广泛。,聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)是一种多聚化合物，分子式为H(OHCH2-CH2)nOH)。,商品名卡波蜡Carbowax,分子量20020000，靠醚键的联结使其分子末端带弱负电荷，目前已衍生达50多种。,1975年Kao和Chayluk报道PEG(polyethylene glycol,PEG)可促进细胞融合，Pontecorvo报道PEG促融效率高于仙台病毒100-300倍。,3.电融合技术,1981年，Scheurich 和Zimmermann发明了电诱导细胞融合法，简称电融合。电融合是指将亲本细胞置于交变电场中，使它们彼此靠近，紧密接触，并在两个电极间排列成串珠状，然后在高强度、短时程的直流电脉冲作用下，相互连接的两个或多个细胞的质膜被击穿而导致细胞融合。,融合参数：主要包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。,优点：,操作简单；适用范围广；无需外源 因子；毒性低；融合率高；参数易控制；,可用于微量细胞融合；可在显微镜观察下定向诱导细胞融合并直接挑选杂交细胞。,缺点：,仪器昂贵，在融合大小不同细胞时存在问题；在融合膜成分差异较大的细胞时存在困难,（二）融合细胞的筛选,细胞融合是一个,随机,的物理过程，经融合后细胞将以,多种形式出现，,需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题,。,基于酶缺陷型细胞,基于,药物抗性所建立的杂种筛选,3.,基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选,4.,由温度敏感突变型细胞组成的杂种细胞的筛选,5.,具有所需性状的杂种细胞的筛选,1.HAT选择系统基于酶缺陷型细胞杂种筛选,HAT是含一定浓度,次黄嘌呤（Hypoxanthine,H）,、,氨基喋呤（,Aminopterin，A,）,及,胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）,的一种,选择性培养基,，其中三种成分与细胞DNA合成有关。,DNA合成途径有两种:,需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶:,（催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸）,次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶:（催化次黄嘌呤产生肌苷）,主要途径由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸是必不可少的媒介，参与嘌呤和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制FH2活性，阻断FH2到FH4合成。,基于HAT培养基的筛选系统,H（Hypoxanthine次黄嘌呤）应急途径中所提供之外源核苷,酸前体,A（Aminopterin，氨基喋呤）阻断核苷酸的从头合成,T（Thymidine，胸腺嘧啶）应急途径中所提供之外源核苷酸前体,HGPRT酶缺陷型细胞株（长期培养系）,不能在HAT培养液中生长,正常细胞,体外生存能力有限，最终也将死亡,融合细胞,最后，只有融合细胞在HAT培养液中存活,2.利用抗药性筛选系统,：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。,亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那,霉,素不敏感,亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感,杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长,3.营养互补筛选系统：,细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。,亲本A：色氨酸缺陷型,亲本B：苏氨酸缺陷型,杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。,4.温度敏感突变型,杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在37度范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。,亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。,亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡那霉素。,杂种细胞能在高温和含卡那霉素的培养基上生长。,（三）融合细胞的克隆化,克隆化的目的就是利用单个细胞培养的技术选育出遗传稳定的、能表达特定性状的细胞系。,其主要方法有：,有限稀释法、半固体培养基法、显微操作法、荧光激活分选法。,（四）融合细胞的应用,1.,基因定位,不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被选择性留下，即,染色体分离,的现象。由此，可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定染色体上进行定位。,例如：HGPRT,人细胞与TK,的小鼠细胞融合后，可用HAT培养基分离得到一种仅含一条人E组染色体的杂种细胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E组染色体上的。,2.,体细胞杂种的致瘤性分析,通过正常二倍体细胞和致瘤性或病毒转化 细胞的融合来进行致瘤性的遗传分析。,3.,遗传缺陷的基因互补,基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。通过这种基因互补，可以用正常基因来治疗由于基因突变或基因缺失的疾病。,4.,分化功能表达调控的研究,通过细胞融合可将不同分化状态或组织类型的细胞构建成为能够存活的种内或种间杂种，同时对杂种细胞内的基因组和胞质观察和分析，了解如何通过相互作用而最终导致原先表达的分化性状熄灭或保留。,5.制作疫苗,6.核移殖和克隆动物,7.单克隆抗体的制备,七、体细胞杂种的遗传,八、展望,思考题,1 什么是细胞融合？有怎样的意义？,2 诱导细胞融合的主要方法有哪些？各有什么特,点？,3 HAT的选择原理是什麽？,