专题1基因工程1.1——1.2.ppt

.,*,专题,1,基因工程,现代生物科技专题,转基因抗虫棉,普通棉花,(,无抗虫特性,),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,棉花细胞,(,含抗虫基因,),棉花植株,(,有抗虫特性,),重组,DNA,导入,形成,基因工程的别名,操作环境,操作对象,操作水平,基本过程,结果,基因拼接技术或,DNA,重组技术,生物体外,基因,DNA,分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因工程的概念,准确切割,DNA,的工具（,“,分子手术刀,”,）,限制性内切酶,DNA,片段的连接工具（,“,分子缝合针,”,）,DNA,连接酶,基因转移工具（,“,分子运输车,”,）,基因进入受体细胞的载体,1.1 DNA,重组技术的基本工具,识别双链,DNA,分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是,原核生物,4000,种。,1,、来源：,2,、种类：,3,、作用：,4,、结果：,形成两种末端,黏性末端,平末端,一、限制性核酸内切酶,“,分子手术刀,”,1,2,3,4,5,脱氧核苷酸的结构,中轴线,在,G,与,A,之间切割,EcoRI,限制酶的作用,大肠杆菌的一种限制酶,(EcoR),只能识别,GAATTC,序列,，并在,G,和,A,之间切开,黏性末端,黏性末端,EcoRI,限制酶的切割,被限制酶切开的,DNA,两条单链的切口，带有几个,伸出的核苷酸,，,他们之间正好互补配对，这样的切口叫,黏性末端,。,平末端平末端,SmaI,限制酶的切割,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的,DNA,两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫,平末端,。,限制性内切酶作用过程,点击播放,SmaI,只能识别,CCCGGG,序列，,并在,C,和,G,之间切开。,中轴线,SmaI,限制酶的作用,在,G,与,C,之间切割,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,原核生物易受自然界外源,DNA,的入侵，,但生物,在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机,制，以防止外来病原物的侵害。,限制酶,就是细,菌的一种,防御性工具，,当外源,DNA,侵入时，会,利用限制酶,将外源,DNA,切割掉，,以保证自身的,安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到,切,割外源,DNA,、使之失效，从而达到保护自身的,目的。,寻根问底,为什么限制酶不剪切细菌本身的,DNA,？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其,DNA,分子中,不具备这种限制酶的识别切割序列,，或者,通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开,。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的,DNA,被切断，并且可以防止外源,DNA,的入侵。,基因的针线：DNA连接酶,G,A A,T T,C,C,T T,A A,G,G,A A,T T,C,C,T T,A A,G,G,C,T T,A A,A A,T T,C,G,G,C,T T,A A,A A,T T,C,G,G,C,T T,A A,A A,T T,C,G,用同种限制酶切割,A,T,G,C,A,T,G,C,连接酶连接,磷酸二酯键,DNA连接酶的作用过程：,二、,DNA,连接酶,“,分子缝合针,”,作用部位：,是磷酸二酯键,（扶手）,不是氢键,（梯子）,DNA,连接酶,将两条,DNA,链连接起来的酶。,核苷酸分子的连接：,A,T,G,C,A,T,G,C,DNA,聚合酶连接单链，把单个脱氧核苷酸连接到,DNA,片段上,？,DNA,聚合酶和,DNA,连接酶有何相同点和不同点？,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,连接,DNA,链,连接部位,双链,在两,DNA,片断之间形成,磷酸二脂键,单链,将单个核苷酸加到已存在的核酸片断,3,末端形成,磷酸二脂键,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,相同点,作用实质,化学本质,不,同,点,模板,作用对象,作用结果,用途,都能催化形成,磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组,DNA,分子,形成,DNA,的一条链,基因工程,DNA,复制,DNA,连接酶与,DNA,聚合酶的比较,只能将,单个核苷酸,连接到已有的,DNA,片段上，形成磷酸二酯键,在,两个,DNA,片段之间,形成磷酸二酯键,E.coliDNA,连接酶：,连接黏性末端,T,4,DNA,连接酶：,连接黏性末端,平末端,DNA,连接酶种类,作为运载体必须具备哪些条件？,1,、能在宿主细胞中自我复制并稳定存在,2,、具一个多个限制酶切位点,3,、具标记基因,种类：,质粒、噬菌体和动植物病毒。,三、基因进入受体细胞的载体,“,分子运输车,”,大肠杆菌的质粒：,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,基因进入受体细胞的载体,“,分子运输车,”,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。,基因进入受体细胞的载体,“,分子运输车,”,小结,基因工程,的工具,限制酶,主要存在于原核生物中,具有专一性,(,识别序列,),切开,DNA,分子的磷酸二酯键,DNA,连,接酶,连接磷酸二酯键,种类,E.coliDNA,连接酶,T,4,DNA,连接酶,运载,工具,具备的,条件,1,、能在宿主细胞中自我复制,并稳定存在,2,、具一个多个限制酶切位点,3,、具标记基因,质粒、,噬菌体、动植物病毒,第二节,基因工程的基本操作程序,细胞的基因结构,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,与,RNA,聚合酶结合位点,真核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,能够编码蛋白质的序列,不能够编码蛋白质的序列,内含子：,外显子：,一、目的基因的获取,目的基因主要是指,_,获取目的基因的常用方法,从基因文库中获取,（基因组文库，部分基因文库）,利用,PCR,技术扩增目的基因,（变性，复性，延伸）,通过,DNA,合成仪用化学方法直接人工合成,编码蛋白质的结构基因,基因文库,基因组文库,部分基因文库（如,:cDNA,文库）,1.,基因文库,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,（一）从基因文库中获得目的基因,2.,基因文库的构建方法,鸟枪法：,供体细胞中的,DNA,许多,DNA,片段,运载体,限制酶,与载体连接载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源,DNA,扩增,目的基因,分离,（直接分离法）,（一）从基因文库中获得目的基因,反转录法：,以目的基因转录成的信使,RNA,为模板，反转录成互补的单链,DNA,，然后在酶的作用下合成双链,DNA,，从而获得所需的基因。,目的基因的,mRNA,杂交双链,(,单链,RNA/,单链,DNA),单链,DNA,反转录酶,核酸酶,H,2.,基因文库的构建方法,DNA,聚合酶,双链,DNA,(,目的基因,),（一）从基因文库中获得目的基因,（二）利用,PCR,技术扩增目的基因,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术,条件：,_,、,_,、,_(,做启动子,),、,_,等,原理：,_,方式：以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循,环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,模板,DNA,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA,聚合酶,指数,2,n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,（二）利用,PCR,技术扩增目的基因,过程：,a,、,DNA,变性（,90-95,）：,目的基因,DNA,受热变性，解链,b,、,复性,（,55-65,）：,引物与单链互补结合,c,、延伸（,70-75,）：,合成链在,DNA,聚合酶作用下进行延伸,（二）利用,PCR,技术扩增目的基因,三、根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使,RNA,序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,1.,用一定的,_,切割质粒，使其出现一个切口，露出,_,。,2.,用,_,切断目的基因，使其产生,_,。,3.,将切下的目的基因片段插入质粒的,_,处，再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,切口,DNA,连接酶,相同的黏性末端,二、基因表达载体的构建,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种,4.,过程,:,二、基因表达载体的构建,5.,基因表达载体的组成：,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,二、基因表达载体的构建,基因表达载体的组成：,目的基因、启动子、终止子、标记基因,启动子,：一段有特殊结构的,DNA,片段，位于基因的首端，,是,RNA,聚合酶识别和结合的部位,。,终止子,：位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的,DNA,片段，使转录在所需要的地方停止下来。,标记基因,：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,二、基因表达载体的构建,小结：,一、获取目的基因的常用方法,从基因文库中获取,（鸟枪法构建基因组文库，逆转录法构建部分基因文库，目的基因在细胞,内,复制）,利用,PCR,技术扩增目的基因,（目的基因在细胞,外,复制）,通过,DNA,合成仪用化学方法直接人工合成,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种,过程,:,二、基因表达载体的构建,基因表达载体的组成：,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,二、基因表达载体的构建,基因工程的基本操作程序第二课时,转化,方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,三、将目的基因导入受体细胞,1,、将目的基因导入植物细胞的方法：,农杆菌转化法,（,1,）农杆菌介绍,（,2,）原理及适用范围,三、将目的基因导入受体细胞,2,、将目的基因导入动物细胞,三、将目的基因导入受体细胞,显微注射法：,转基因动物中采用最多，最为有效的方法,操作程序：,表达载体提纯,从雌性动物体内取出卵,显微注射,胚胎早期培养,胚胎移植,显微注射仪,固定吸管,微量注射针,针尖极细（,0.1,至,0.5m,）,3,、将目的基因导入微生物细胞,（,1,）常用大肠杆菌：,（,2,）,大肠杆菌的转化方法,首先用,Ca,2+,处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中,DNA,分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体,DNA,分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收,DNA,分子，完成转化过程。,检测,鉴定：,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA,分子杂交,分子杂交,抗原抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,DNA-DNA,杂交双链分子,变性,复性,不同来源的,DNA,分子,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,方法,DNA,分子杂交,复性,RNA,DNA,检测目的基因是否转录出了,mRNA,方法,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法,抗原抗体杂交,鉴定：,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,1.2,基因工程的基本操作程序,基因工程程序总结,一、获取目的基因的常用方法,从基因文库中获取,（鸟枪法构建基因组文库，逆转录法构建部分基因文库，目的基因在细胞,内,复制）,利用,PCR,技术扩增目的基因,（目的基因在细胞,外,复制）,通过,DNA,合成仪用化学方法直接人工合成,基因表达载体的组成：,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,二、基因表达载体的构建,转化,方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,三、将目的基因导入受体细胞,检测,鉴定：,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA,分子杂交,分子杂交,抗原抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,1）以下说法正确的是,A、,所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,B、,质粒是基因工程中唯一的运载体,C、,运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接,D、,基因控制的性状都能在后代表现出来,C,随堂练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是,A、,能复制,B、,有多个限制酶切点,C、,具有标记基因,D、,它是环状,DNA,D,随堂练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是,A、DNA,连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B、,限制性内切酶用于目的基因的获得,C、,目的基因须由运载体导入受体细胞,D、,运载体和目的基因用同一种限制酶处理,A,随堂练习,4）有关基因工程的叙述正确的是,A、,限制酶只在获得目的基因时才用,B、,重组质粒的形成在细胞内完成,C、,质粒都可作为运载体,D、,蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,随堂练习,5）基因工程是在,DNA,分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是,A、,人工合成目的基因,B、,目的基因与运载体结合,C、,将目的基因导入受体细胞,D、,目的基因的检测和表达,C,随堂练习,1.,有关基因工程的叙述中，错误的是,A,、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种,B,、重组,DNA,的形成在细胞内完成,C,、目的基因须由运载体导入受体细胞,D,、质粒都可作为运载体,随堂练习,BD,2.,下列四条,DNA,分子，彼此间具有粘性末端的一组是,A,B,C,D,D,3.,在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的,DNA,片段，需使用,A.,同种限制酶,B.,两种限制酶,C.,同种连接酶,D.,两种连接酶,随堂练习,A,4.,不属于质粒被选为基因运载体的理由是,A,、能复制,B,、有多个限制酶切点,C,、具有标记基因,D,、它是环状,DNA,D,细胞的基因结构,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,与,RNA,聚合酶结合位点,真核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,能够编码蛋白质的序列,不能够编码蛋白质的序列,内含子：,外显子：,