分子遗传学PPT.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Contents,Materials and Methods,Results,Discussion,3,Abstract,1,2,4,1,摘要,1.1 在栽培稻(,Oryza sativa,)亚种籼稻和粳稻的种间杂交的杂种中，杂种雄性不育基因,S24,通过等位基因间的相互作用，选择性地致使携带有粳稻等位基因,S24-j,的雄胚子败育。,1.2 本研究作者分析了这种雄性不育是否仅仅由,S24,单个座位引起的。,结果发现,S24,受到上位性的调控。,1.3 对BC,2,F,1,群体进行QTL 分析，发现了一个位于,水稻第2 染色体,与,S24,互作的、新的不育位点，该位点被命名为,EFS,（,S24,互作因子，,E,pistatic,F,actor for,S,24）。,2,）近等位基因系,NILs,在近等位基因系中，除了S24基因位点不同，染色体他的位点都是相同的。,Asominori（）RCSSLs（）,（具有粳稻遗传背景的近等位基因系）,IR24（）RCSSLs（）,（具有籼稻遗传背景的近等位基因系）,AI-NIL-F,1,IA-NIL-F,1,3,）日本晴和,93-11,的杂交后代,Nipponbare 93-11,F,1,Nipponbare,BC,1,F,1,Nipponbare,BC,2,F,1,Nipponbare,BC,3,F,1,Nipponbare,BC,4,F,1,BC,2,F,2,BC,3,F,2,Selfing,Selfing,多样性和表型分析,QTL,分析,2.2,表型鉴定,1）花粉的采集；花粉的固定染色；花粉的镜检统计；,2)每个植株统计超过300个花粉粒；,3）呈深红色的正常大小的饱满花粉粒为可育表型；呈浅红色或无色空瘪、畸形的花粉粒为不育表型。,4）在本研究中，,花粉可育率90，为可育；,花粉可育率70-90，为部分不育；,花粉可育率30-70，为半不育；,2.3 DNA,分析和连锁图谱的构建,1）DNA样品的准备；,2）引物的设计：根据日本晴和93-11的DNA序列设计得到SSR标记引物；,3）PCR反应：变性，94,20 S；退火，56,20 S；延伸，72,30-60 S；共30个循环。,4）PCR产物的电泳和数据统计；,5）连锁图谱的构建：应用Map Manager QTX version 0.30软件进行连锁图谱的构建。,2.4 QTL,分析和,EFS,位点解析,1）QTL和上位互作分析,在Map Manager QTX version 0.30软件中进行标记回归分析，检测到了QTL之间的上位互作效应。双向方差分析（a two-way ANOVA）计算得到他们的互作效应以及重要性。,2）EFS位点的定位将用到,BC,2,F,2,，,BC,3,F,2,和,BC,4,F,1,群体。在140株,S24,杂合子植株中，通过标记辅助选择确定了,mS1,和,mS2,被用来定位,EFS,。,3,结果,S24,基因在2008年由Kubo,et al,.在粳稻栽培稻中的一个籼稻染色体片段中发现。,S24,位点引起的花粉不育归因于在杂合子中携带,S24-j,（,japonica,allele for S24)基因的雄配子选择性败育，导致了在,S24,位点的严重分离变相有利于分离后代群体中得籼稻等位基因（Kubo,et al,.2008）。,上面讲到的花粉不育主要是因为在,S24,位点的等位基因的相互作用。如果等位基因间的相互作用足以引起花粉不育的表型，那么同样的表型应该可以在任何遗传背景下都可以被看到？,3.1,S24,基因的不育性依靠其遗传背景,3.1 S24,基因的不育性依靠其遗传背景,为此，我们培育了S24的两个近等位基因系，结果如下：,粳稻遗传背景下的近等位基因系：,AI-NIL-F,1,表现为花粉半不育（41.8的花粉可育）(Figure 1)。,AI-NIL-F,2,表现为严重的分离变相，,jp/jp,基因型比例为4.2，表明在后代中优先传递籼稻,S24-i,等位基因(Table 1)。,籼稻遗传背景下的金等位基因系：,IA-NIL-F,1,表现为92.9的花粉可育性(Figure 1)。,IA-NIL-F,2,中，基因型比例jp/jp:in/jp:in/in=23:21:25，jp/jp基因型比例为33.3，即使他们的分离比也偏离了1:2:1。,这些结果证明了，在籼稻遗传背景中，S24杂合体的S24-j雄配子是可育的，且能正常传递给后代。因此，我们能说，S24杂合基因仅仅在粳稻遗传背景下才能导致雄性不育，这样的花粉不育的遗传机理必然涉及到了基因的上位作用,。,3.2,花粉不育的上位因子解析,由于日本晴和93-11的基因组已经被完全测序，因此我们决定用这两个品种进行进一步的分析。首先，我们需要确定同样的S24位点存在日本晴和93-11中，然后鉴定上位基因隐藏在粳稻遗传背景中。,1）作为亲本的日本晴和93-11均有90的花粉可育性；,他们的互补杂交的F,1,代（日本晴/93-11 和93-11/日本晴）分别表现了37.8%和 42.9%的花粉可育性；,我们在BC,1,F,1,回交后代的8个植株中鉴定到了一个可育的分离体（表现为90.8的花粉可育性），他携带了包含有S24位点的杂合片段。,3.2,花粉不育的上位因子解析,2）检测影响花粉不育的其他遗传因子,用,BC,1,F,1,群体的可育植株与日本晴回交得到分离的,BC,2,F,1,群体，它们显示了花粉可育性的广泛分布（37.3-100的花粉可育），即存在两种不育表型：半不育和部分不育(Figure 2A)。,我们用了均匀分布在12条染色体上的76个PCR标记对,BC,2,F,1,群体进行了QTL分析，检测到了两个可能的与花粉不育有关的QTL位点，即2号染色体上的qPS2位点和5号染色体上的qPS5位点(Table 2)。,qPS5 QTL与标记chr05-109和mS3连锁，在杂合基因型的植株中降低花粉的可育性。由于其位点和表型效应与,S24,相同，所以它被认为就是,S24,位点。,qPS2 QTL与标记mE4连锁，在杂合的植株中增强花粉的可育性。,3.2,花粉不育的上位因子解析,3）全基因组的相互作用分析鉴定影响花粉可育的重要的上位性标记对,结果我们得到了两对标记：,qPS5,（,S24,)/,qPS2 和 Chr4-3173/chr9-0755,双向方差分析表示，一个重要的相互作用因子存在于标记位点,mS3,和,mE4,之间，即,qPS5,（,S24,)和,qPS2,之间(Figure2B,Table S2)。,mS3,（,S24,)的杂合位点与日本晴的纯合的,mE4（qPS2）,位点组合大量的降低了花粉的可育性（63.7），而其他基因型组合的花粉可育性95.0。,这样的结果表示，,qPS2,可能与,mS3,（,S24,)联合作用于花粉的可育性。由于2号染色体的这个区段并未见报道过相关的花粉不育基因，故将,qPS2,这个新位点命名为,EFS,(,E,pistatic,F,actor for,S,24,)。,3.2,花粉不育的上位因子解析,另外一对相互作用位点,Chr4-3173/chr9-0755,，,也严重的降低了花粉的可育性（65.5）(Table S2)。然而，进一步分析，他们之间的位点并没有显示任何相互作用影响花粉的不育性（数据没有显示）。,3.3,EFS,位点的遗传解析,1）,在,BC,2,F,2,和,BC,3,F,2,群体中，根据EFS连锁的mE4标记和S24连锁的mS2/mS3标记，我们共评估了9个基因型种类。,3.3,EFS,位点的遗传解析,由上面的表格可以发现，杂合基因型,S24-i/S24-j,仅只有当与纯合的,efs-j/esf-j,组合时，才能表现出花粉不育。而其他的基因型组合没有表现异常的花粉表型，这久充分的证明了EFS的存在；也充分证明了当隐性,esf-j,等位基因纯合时，它在S24杂合体中导致了雄性不育。,2）对,BC,4,F,1,群体在,花粉育性表型上的分析,也证明了,EFS,的影响作用(,Figure 3,B and C,)。,3）在,BC,2,F,2,，,BC,3,F,2,和,BC,4,F,1,群体中，基因型,S24-i/S24-j efs-j/esf-j,表现了两种表型：半不育（30.3-59.1）和部分不育（74.0-82.3）(Figure S2)。,3.3,EFS,位点的遗传解析,3.3,EFS,位点的遗传解析,3.3,EFS,位点的遗传解析,4）检测,BC,2,F,2,，,BC,3,F,2,和,BC,4,F,1,群体中S24杂合基因型的共140株植株，我们发现了在,EFS,和标记位点之间发生重组的两株植株,：,BC,4,F,1,-8-4-39,在,mE3,和,mE4,之间发生重组。,BC,3,F,2,-8-4-37 在,mE4,和,mE5,之间发生重组。,这两个重组体均表现花粉可育表型，因此我们可以确定,EFS-i,存在两个重组体的染色体重叠区域。于是，我们便可以把,EFS,基因定位在2号染色体上,mE3,与,mE5,之间的817kb大小的片段上,(Figure 3D),。,3.3,EFS,位点的遗传解析,3.4,在孢子体中,选择性传递的,S24-j,配子的不育性被,EFS-i,抵消,双杂合体(NILS,24+EFS,)与日本晴互补杂交,如果EFS在配子体中发挥作用，S24-j/efs-j基因型的花粉将被选择性淘汰；相反，如果在孢子体中发挥作用，则其基因型比例率符合理论比,1:1:1:1（Table 3）。,双杂合体,(NILS,24+EFS,),与日本晴互补杂交,在两个不同的后代群体中，双杂合体(NILS24+EFS)产生S24-j/S24-j基因型后代的比例为17.8（,BC,3,F,2,-8-4）和21.7（,BC,4,F,2,-8-4-1）。这样的比例明显高于,BC,3,F,2,-8-6群体的遗传频率5.7。,注：,BC,3,F,2,-8-6是,BC,3,F,2,-8-4的一个姐妹株系，基因型为,S24-i/S24-j efs-j/efs-j,。,双杂合体,(NILS,24+EFS,),与日本晴互补杂交,因此，由上面的实验分析可以得到以下结论：,EFS,基因是在孢子体中发挥作用的；,在,EFS-i/efs-,j杂合体中，,S24-j,雄配子能正常发育且能将其基因传递给后代；,在,S24,杂合子中，,EFS-i,可以抵消,S24-j,在花粉中的不育性；,4,讨论,一般情况，“花粉杀手”导致花粉不育仅仅是在,S24,位点杂合时。因此过去认为，等位基因间的互作是引起雄性杂交不育的关键。,我们研究表明，仅仅当,efs-j,位点纯合时，,S24,等位基因间的相互作用才变得活跃；,S24-EFS,间的相互作用可解释为：孢子体和配子体之间通过两个独立位点来相互作用（,Figure 4A,）,。,1,）多个上位互作因子影响,S24,基因,1,）多个上位互作因子影响,S24,基因,另外一个互作因子，,S35,，已经被证明在,S24,杂合子中与,S24,作用增强花粉的不育性（Kubo,et al,.2008)。,S35,基因需要,S24-i,等位基因的存在才能引起花粉不育，但,S24,能独立于,S35,诱导半不育的发生。因此他们之间的作用是单向的（,Figure 4B,）。,S35,与,EFS,之间的关系还有待进一步研究。,另外，在一个水稻杂交组合中，由于上位三个不连锁的位点导致的雌性不育被发现。一个孢子体和两个配子体基因相互作用导致了携带一对特殊等位基因的雌配子选择性败育(Kubo and Yoshimura 2005)。,他们进一步提出：杂交不育是由多种上位因子组成的复杂网络来控制的。,2,）分子和功能方面的,S24,和,FES,基因组序列数据在,S24,和,FES,区域没有显示主要的结构差异。我们将,S24,精细定位到了,mS1,与,mS2,之间的122kb的区域，确定了,ANK-3,作为,S24,产物的主要候选蛋白。因此，有可能是EFS能编码一种蛋白质与ANK-3结合。因为EFS候选区域包含了大约80个不包含转座子的预测基因，所以仍需进一步确认EFS影响花粉不育是否涉及到了它与ANK-3蛋白的相互作用。,同时，串联排列的,ANK3,（三个重复）在日本晴和93-11中的122kb区域中被发现，这表明,ANK3,位点的等位基因多样性可能是花粉不育的一个影响因素。,3,）本研究中的几个问题,（1）在本实验中的遗传群体中，等位基因,S24,在后代并没有严格按照遗传分离定律进行分离，而是发生了分离变相？,根据相关的一些研究，,S24,的遗传和基因组的功能非常相似于果蝇中的分离变相基因系统（SD）。SD是一个多基因的自私基因复合体（超基因簇），在这个超基因簇里，不同的等位基因组合调控分离变相和决定表型的程度(Presgraves 2007)。,在水稻中，如果存在像SD一样的系统，那么,S24,只是这个系统中得一个元件，可能还会有很多的上位因子存在，并形成一个复杂的机理来调控水稻杂交雄性不育。,3,）本研究中的几个问题,（2）相关不育的,S24,突变是否出现在上位基因,EFS,突变之前？,在分析澳大利亚的一个水稻品种,“Dular”,时，发现了一个不育的中性等位基因,S24-n,(Wang,et al,.1998;Zhao,et al.,2010),。这样一个不育的中性等位基因在水稻杂交不育系统的进化历史中扮演着一个什么角色？,目前，这些问题还不清楚。,也还有更多的问题需要我们去寻找答案！,-,