基因工程与基因重组.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物工程定义,生物工程是,生物技术,的总称，是对生命有机体在,分子,水平、,细胞,水平、,组织,水平、,个体,水平进行不同层次的创造性设计和改造，使之能定向组建具有特定性状的新物种或新品系，从而造福人类的现代应用技术学科。,生物技术的四大体系,基因工程,细胞工程,酶工程,发酵工程,重组DNA技术（recombinant DNA technique）,，又叫,DNA,克隆,（DNA cloning）,。在体外将各种来源的遗传物质同源的或异源的、真核的或原核的、天然的或人工合成的,DNA,与,载体DNA,结合成一,具有自我复制能力,的DNA分子（复制子），继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。这类克隆是在分子水平上操作，故又称,分子克隆（molecular cloning）,。,一、重组DNA技术相关概念,（一）DNA克隆,由于,DNA克隆,研究对象常常是特异的基因片段，所以又称作,基因克隆（gene cloning）,。实现基因克隆所采用的方法及相关工作统称为,基因工程（genetic engineering）,。,1997年2月23日,英国 Wilmut,粘性末端,质粒,目的基因,粘性末端,匹配的粘性末端,酶切后的目的基因片段,接(连接),连接后的重组质粒DNA分子,重组质粒,目的基因,大肠杆菌,转(转化),染色体,真好玩!,筛(筛选,),分解抗生素的酶,含抗生素的培养基,还活着!,玩完啦!,大肠杆菌,大肠杆菌,大量生长,提取大量,质粒,酶,切,鉴定,您已经掌握基因克隆的主要步骤！,分,离目的基因和载体DNA。,用合适的酶,切,割上述两者，产生匹配的末端。,连,接,酶将目的基因装入载体。,转,入细菌。,筛,选具有抗药性克隆。,（二）重组DNA中的工具酶,限制性核酸内切酶,连接酶,聚合酶,多聚核苷酸激酶,碱性磷酸酶,1.限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）,定义：,能识别DNA,的,特异序列,，并在识别位点或其周围,切割双链DNA,的一类核酸内切酶。,主要来源于原核生物，可将侵入宿主细胞的外源性DNA迅速降解，而对细菌自身的DNA，则通过甲基化酶在该限制酶切位点甲基化修饰而保护自身的DNA不被降解。,限制性内切酶和甲基化酶,共同构成细菌的,限制和修饰,系统。限制性内切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。,限制酶的命名,限制酶的命名是根据含有该酶的微生物种属而定。通常有三个斜体字母的缩写表示。,第一个大写字母,取自,细菌属名,的第一个字母；,第二、三个小写字母,取自微生物,种名,的头两个字母；,第四个字母,代表该微生物同种内不同的,株系,；如果同一株名发现几种限制酶，则根据其被发现和分离的先后顺序，用,罗马数字,表示。,例如，从大肠杆菌（,Escherichia Coli,）RY,13,株中发现分离的第一种限制酶，称为,Eco,R I。,限制性内切酶的分类和特点,根据限制酶的组成、辅因子及切割DNA方式不同，可分为 I、II、III型。重组DNA技术中常用的是,II型限制性内切酶,。II型酶作用特点是有严格的识别、切割顺序，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段,5 端为磷酸基,，,3 端为羟基,。识别顺序一般为46个碱基，通常是,回文结构（palindrome）,。,回文结构,II类限制性核酸内切酶识别DNA 位点的核苷酸序列呈,二元旋转对称,，通常称这种特殊的结构顺序为,回文结构,。,Eco,R I,5 GAATT C3,3 C TTAAG5,II型酶切割双链DNA产生,3种,不同的切口：,在,对称轴中心,同时切割双链，产生,平末端,或称钝性末端（,blunt,end），,如,Hpa,I：,5 GTT,AAC3,Hpa,I 5 GTT AAC3,3 CAA,TTG5 3 CAA TTG 5,在,对称轴两侧相对位点,分别切割一条链。从,5 端,切割产生,5 端突出的粘性末端,，如,Eco,RI,：,5 G,AATT C3,Eco,R I 5 G AATTC3,3 C TTAA,G5 3 CTTAA G 5,从,3 端,切割产生,3 端突出的粘性末端,。如,Pst,I,：,5 C TGCA,G3,Pst,I 5 CTGCA G3,3 G,ACGT C5 3 G ACGTC 5,表15-2一些常用的限制性内切酶位点,一些限制酶虽然识别序列不完全相同，但能产生相同类型的粘性末端，称为,同尾酶,，所产生的末端称,配伍末端（compatible end）,，可进行相互连接。产生平末端的酶切割DNA后，也可彼此连接。,连接酶可催化DNA分子中相邻,5 磷酸,和,3 羟基,末端之间形成,磷酸二酯键,，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。常用的有T,4,（噬菌体）DNA连接酶和,E,.,Coli,DNA连接酶。,2.DNA连接酶,3.聚合酶,重组DNA技术中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA为模板在体外合成DNA或RNA。可分为,DNA聚合酶,和,RNA聚合酶,两大类。,名称 功能及应用,大肠杆菌DNA聚合酶I 以,DNA,为模板，催化,5 3,核酸链的延长，另有,3 5 的外切酶,大片段（klenow）,活性。常用于DNA 3 末端的标记和填充、cDNA第二链的合成、,DNA测序。,Taq DNA聚合酶 以,DNA,为模板，催化,5 3,核酸链的延长，另有,弱的5 3的外切,酶,活性，耐高温。常用于PCR及DNA测序。,末端转移酶 催化NTP中的NMP通过其磷酸基与DNA 3-OH连接而使DNA链,延长，,无需模板,。常用于3 端标记或形成DNA共聚尾巴。,逆转录酶 以,RNA,为模板，合成,cDNA链,（5 3），另有,RNA酶H,活性。常,用于cDNA第一、二链的合成及反转录PCR（RT-PCR）。,RNA聚合酶 以,DNA,为模板合成,RNA,。常用于离体条件下，合成单链RNA作为,杂交探针。,T,4,多核苷酸激酶（polynucleotide kinase）催化ATP的,-磷酸基,转移至DNA或RNA的,5 末端羟基,上。常用于单链或双链DNA和RNA探针的5 端标记。,4.多聚核苷酸激酶,5.碱性磷酸酶,牛小肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase,CIP），催化DNA或RNA的,5 磷酸基水解,。常用于去除线状载体DNA两端的5 磷酸基团，,防止载体自身连接环化,；也用于用,32,P标记DNA的5 末端之前除去原来的5 磷酸基。,应用重组DNA技术有时是为分离、获得某一,感兴趣的基因或DNA片段,，或是获得感兴趣的表达产物,蛋白质,。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因。目的基因有两种类型，即,cDNA,和,基因组DNA,。,（三）目的基因（target gene）,（四）基因工程载体,基因载体：,或称,克隆载体（cloning vector）,是在基因工程中为“携带”感兴趣的,外源DNA,（,目的基因、外源基因,）、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，具有自我复制和表达功能。其中，为使插入的外源DNA 序列可转录、进而翻译成多肽链而特异设计的克隆载体又称,表达载体,。,能,自主复制,并能,带动插入的目的基因一起复制,。,具有一个以上的单一,限制性酶切位点（多克隆位点,，,multiple cloning sites），,以便目的基因的 插入。,具有合适的,筛选标记,（如抗药性基因，酶基因等），以,便筛选阳性克隆。,载体,分子量小,，以便容纳较大目的基因，拷贝数高。,在细胞内,稳定性高,，以便确保重组体稳定传代而不易丢失。,理想载体应具备的基本条件,载体的分类,质粒,（plasmid）,噬菌体,（phage）,病毒,（virus）,克隆载体,（cloning vector）,表达载体,（expression vector）,常用的载体按来源分为,载体按得到的产物分类可分为,质粒（plasmid）,质粒是存在于细菌染色体外的小型,环状双链DNA,分子，能在宿主细胞,独立自主地进行复制,，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些,遗传信息,，会赋予宿主细胞,新的遗传性状,。因为质粒DNA有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组 DNA操作的载体。,染色体,质粒,pBR322 质粒图谱,氨苄青霉素抗性基因,四环素抗性基因,多克隆位点,噬菌体载体,噬菌体,是一种细菌病毒，可作为克隆载体。,目前使用的噬菌体载体主要有,噬菌体,衍生物载体、,M,13,噬菌体,载体等。除M,13,噬菌体载体外，这类载体的特点是其,容量,比质粒载体,大,，即可插入较大的外源DNA片段（如20kb以上）。,可以在体外包装产生感染性很高的噬菌体颗粒。,噬 菌 体,头部,尾部,尾丝,噬菌体,噬菌体（,lambdla bacteriophage,）,是一种大肠杆菌病毒，为,线性双链,DNA,，,它的两端各有12个碱基的,互补粘性末端,，称,COS,位点,。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成,环状分子,。,DNA,在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。,噬菌体侵入细菌后，即可,裂解生长,（环状,DNA,在细菌中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌），又可以,溶源生长,（,噬菌体,DNA,整合到细胞染色体基因组,DNA,中，与染色体,DNA,一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解）。,噬菌体感染细菌示意图,裂解生长,噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，而对裂解生长并非绝对需要，因此可以缺失或被,外源DNA,取代。经改造的噬菌体衍生载体可分两类:,一类是,插入型载体,，即外源基因插入到载体上单一的限制酶位点，如gt系列等。,另一类是,置换型,，即两个限制酶位点之间的DNA片段可被外源DNA取代，如Charon，EMBL系列等。,M,13,噬菌体载体,M,13,噬菌体基因组是,单链环状DNA,，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链DNA转变成复制型双链DNA，可提取出来做基因重组。,经改造的M,13,噬菌体有M,13,mp系列和pUC系列。,M,13,噬菌体载体,pUC19,互补,：单独存在的,及,片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有 半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（X-gal）变为,蓝色化合物,。,突变型,lac,-,E.coli,表达,-,半乳糖苷酶的,片段,。,如果插入的外源基因是在lacZ基因内，就会影响lacZ的表达，利用,lac,-,E.coli,为转染或感染细胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现,白色菌落,；若无外源基因插入，则出现,蓝色菌落,。,多克隆位点,编码,-,半乳,糖苷酶的,片段,病毒载体,是一类,真核载体,，能把基因引入到 真核细胞中，并在其中被表达。因此是研究真核细胞表达及调控的有力工具。如:腺病毒、逆转录病毒、乳头瘤病毒等。,二、重组DNA技术基本原理,目的基因,的获取,克隆,载体,的选择和构建,外源基因与载体的,连接,重组,DNA,导入受体菌,重组体的,筛选,克隆基因的,表达,（一）目的基因的获取,化学合成法,基因组,DNA,cDNA,聚合酶链反应,1.化学合成法,已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出编码该多肽链的核苷酸序列，再利用,DNA合成仪,通过化学合成原理合成目的基因。,利用该法合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等,2.基因组DNA,利用,限制性核酸内切酶,将染色体DNA切割成一定基因水平的许多片段，将这些片段与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而,转入受体菌,扩增，使每个细菌内都携带,一种,重组DNA分子的多个拷贝。,不同细菌所包含的重组DNA分子可能为不同的染色体DNA片段，这样全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染色体的整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有,基因组DNA片段的集合,称为,基因组DNA文库,（genomic DNA library）。基因组DNA文库涵盖了基因组全部的遗传信息。,建立基因组文库后，需结合适当,筛选方法,从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，再进行,扩增,，将重组DNA分离、回收，以获得目的基因。,3.cDNA,把细胞,总mRNA,通过逆转录合成,总cDNA,，再与适当载体连接后转入受体菌，从而得到含有某种生物体全部cDNA集合（称为,cDNA 文库,，cDNA library）。然后用适当的方法从cDNA文库中,筛选,出目的cDNA。,cDNA文库,的特点是它只包括已经,被转录,成mRNA的那些,基因序列,，且,不包括内含子及调控序列,，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。,但由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的mRNA种类就不同，由此产生的cDNA又是独特的。与基因组DNA文库类似，由,总mRNA,制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。,4.聚合酶链反应（polymerase,chain,reaction,PCR）,参见437页,Chain Reaction,Polymerase,chain reaction,PCR的产物数目,以指数级方式增长,中子的释放数目,以指数级方式增长,中子,原子核,短时间内巨大的,能量释放，,原子爆炸,DNA片段,Cycle 1,Cycle 2,Cycle 3,Cycle N,理论上可达2,n,个拷贝,原料,（,pg,）,产物,(,ug,),PCR 的基本原理,体外,高效、快速、特异,地扩增目的基因或DNA片段的,技术,。,其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使,目的DNA,得以迅速扩增,DNA的体内复制：,原料：,模板DNA（,基因组DNA,），,随机小分子RNA引物，dNTPs,酶：,DNA聚合酶，解旋酶，引发酶,反应条件：,胞液环境，37,反应过程：,模板DNA解旋、引发体的形成、延长,（三阶段）,产物：,模板DNA（,基因组DNA,）拷贝数增加,一倍,原料：,模板DNA（,基因组DNA，cDNA,）,一对,特异性,寡核苷酸引物，dNTPs,酶：,Taq DNA聚合酶,反应条件：,合适的缓冲液，三种,变化的温度,（94，50-70，72），一定的,循环数,（25-35）,反应过程：,DNA,模板变性（解链）、模板与引物退火、引物延伸,（三阶段，,多循环,）,产物：,目的,DNA,（,特异性）拷贝数增加,2,n,倍,PCR：,DNA模板变性,与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的,双链DNA,是通过95左右的,高温,使其发生变性，形成,单链DNA,模板与引物退火,PCR通常需要两条,寡核苷酸链,作为DNA合成时的,引物,（primer）,这两个引物分别与待扩增模板DNA的,目标片段,两端的序列互补。在降低温度的过程中，通过控制,退火条件,，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。,primers,引物,短,，不易缠绕；,设计的引物是与模板DNA两端序列互补；,引物的量,远大于,模板分子的量，引物与模板DNA形成双链的几率远远高于DNA分子自身的复性。,引物延伸,在PCR反应体系中的,DNA聚合酶,，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物53方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。,Taq 酶,dNTPS,新合成的链又可作为下轮循环反应的模板,。,热变性-复性-延伸,的过程就是一个PCR循环 每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲，扩增DNA产量是呈指数上升的，即n个循环后，产量为2,n,拷贝。而实际上，PCR的扩增倍数为,（1+X）,n,，X为扩增效率，平均为75%,热变性-复性-延伸,25-35 次循环,百万倍扩增,尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。,在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现,平台效应,(Plateau),，产物的量不再增加。,“平台效应”出现的迟早还取决于,酶的性能,、模板DNA的,拷贝数、dNTP浓度,等多种因素。,（三）外源基因与载体的连接,（二）克隆载体的选择,粘性末端连接,平端连接,同聚物加尾连接,人工接头连接,1.粘性末端连接,外源DNA片段与载体用,同一种,限制性内切酶切割，获得相同的粘性末端，相互互补配对，在DNA连接酶作用下，形成重组DNA分子。,5C,CG G3 5C,CGG3,3G GC,C5 3G GC,C 5,Hpa II,2.平端连接,因载体分子和目的DNA分子之间并不一定都产生互补的粘性末端，有的限制性内切酶只能切成,平末端,。平末端仍用,T,4,DNA连接酶,连接，只是,效率低,，需要的DNA浓度更高。,3.同聚物加尾连接,同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如polyG与poly C之间的,退火,作用完成连接。,在,末端转移酶,作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，如将poly（dC）加到双链DNA片段3 羟基上，而将poly（dG）加到质粒载体3 羟基上，制造出,粘性末端,，然后进行粘性末端连接。,4.人工接头连接,接头（linker）是指人工合成的一段,双链寡核苷酸,，其中包含一个（或两个）,酶切位点,。首先将接头与目的DNA片段进行平末端连接，继而用适当的内切酶将接头部位切出粘性末端，最后与载体进行粘性末端连接。,（,四）重组体导入受体细胞,在分子克隆中，将,质粒,或以它为载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为,转化（transformation）,。,以,噬菌体,和真核,病毒,作载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为,转染（transfection）,。,基因片段（特别是纯化的DNA）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预先加以处理，使其提高基因导入细胞的效率。例如用低温,CaCl,2,（冰浴）处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这种经过预处理的、,容易导入外源核酸,分子的受体细胞被称作,“感受态细胞”（competent cell）,。,（,五）重组体的筛选,通过转化、转染等方式，重组体DNA分子被导入受体细胞，经适当涂布的培养基培养得到大量转化子菌落或转染噬菌斑。因为,每一重组体,只携带,某一段外源基因,，而转化或转染时,每一受体菌,又只能接受,一个重组体分子,，所以设法将众多的转化菌落或噬菌斑区分开来，并鉴定哪一菌落或噬菌斑所含的,重组DNA分子,确实带有,目的基因,，即可得到目的基因的克隆，这一过程即为,筛选（screening）,。,根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况不同，可采取不同的筛选方法。,1.,直接筛选法,（1）抗药性标志筛选,（2）标志补救,（3）分子杂交法,2.非直接筛选法,免疫学方法,抗药性标志筛选,如果克隆载体携带有某种,抗药性标志基因,，如Amp,r,或Tet,r,，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗生素的培养板上生存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。,如果重组DNA时将,外源基因插入标志基因内,，如插入Tet,r,内，使标志基因Tet,r,失活,，阳性重组子则不能在含有Tet的培养板上生长。用,插入失活,筛选的重组子载体往往带有,另一个抗生素抗性基因,如Amp,r,，因此可以通过,双抗生素,对照筛选，即阳性转化子可以在含Amp的培养板上生长而不能在含Tet的培养板上生长。,标志补救,若克隆的基因能够在宿主菌内表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，则可以利用,营养突变菌株,进行筛选，这就是,标志补救（marker rescue）,。,-互补：,通过,蓝白斑,筛选可以筛选、鉴定重组体与非重组体载体。,当外源基因插入后，LacZ基因被破坏，不能合成完整的-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成,白色,-半乳糖苷酶能分解X-gal，形成,蓝色,菌落。,分子杂交法（molecular,hybridization,）,参见435页,核酸分子杂交,（molecular hybridization）：指用标记的已知DNA或RNA片段（,探针,）检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。,探针,：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。,核酸分子杂交的基本原理,变性（denaturation）,复性（renaturation）,杂交（hybridization）,预杂交（prehybridization）,变性（denaturation）,概念,：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双股螺旋或发夹结构打开，有规则的结构被破坏，形成单链分子。,变性的因素,：加热、酸、碱、尿素、甲酰胺等,增色效应,（,hyperchronic effect）：,核酸变性时，紫外吸收值,A260,随之升高的现象。,热变性,DNA的熔解曲线,Tm值,（melting temperature）:热变性时，50%DNA分子变性的温度。又叫解链温度、熔解温度。,复性（renaturation）,概念,：在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新缔合，形成双链的过程。,热变性后，,缓慢降低温度,至比Tm值低20-30,时，变性的单链DNA可恢复其双链结构，称为,退火,。,杂交（hybridization）,来源不同,的两条,单链,核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋。如DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA杂交分子。,预杂交（prehybridization）,概念,：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。,常用的封闭物,：变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA，又称为覆盖DNA。,变性、复性、杂交示意图,核酸探针,：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。,探针,分类,放射性,标记核酸探针,非放射性,标记核酸探针,印迹杂交,概念,：指将待测核酸序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。,探针与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少可反应出待测的核酸分子是否存在相应的基因序列及其大小。,分类,DNA印迹杂交（Southern blotting）,RNA印迹杂交（Northern blotting）,提取DNA,限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳,碱变性,转移到NC膜,与DNA或RNA探针,杂交,放射自显影,DNA印迹杂交（Southern blotting）,检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因,将琼脂糖,凝胶,上的DNA分子转移到,硝酸纤维素膜,上,菌落原位杂交（,In situ hybridization）,含有与探针互补序列的菌落或噬菌斑经放射自显影后，在X光底片上出现杂交点。,将转化后得到的菌落或噬菌斑原位转移到NC膜上，得到一个与平板菌落或噬菌斑分布完全一致的复制品。,原位裂解细胞，碱变性，核酸分子被固定于膜上,加入标记的DNA或RNA探针进行,杂交,根据阳性反应位置，可从保留的母板上挑出所需的,阳性克隆,。,RNA,印迹杂交（Northern blotting）,检测靶分子为RNA。主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。,与Southern blotting不同的是在转移前不需进行限制性内切酶切割。,核酸杂交分类表,杂交方法,适 用 范 围,Southern 印迹,检测经凝胶电泳分开的DNA分子，需转印到膜上,Northern 印迹,检测经凝胶电泳分开的RNA分子，需转印到膜上,斑点杂交,检测未经分离的、固定在膜上的DNA或RNA分子,菌落或噬菌斑杂交,检测固定在膜上的、经裂解后从细菌或噬菌体中释放出的DNA分子,原位杂交,检测细胞或组织中的DNA或RNA分子,免疫学方法,免疫学筛选是利用特异,抗体,与目的基因表达的,抗原,产物相互作用进行筛选，特异性和敏感性也较高，尤其适用于筛选不为宿主菌提供任何选择标记的基因，或者是已获得了该基因编码的蛋白质产物的多克隆或单克隆抗体，用这些抗体来检测目的基因表达的产物。免疫学方法很多，如,Western blot,，免疫化学方法、酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫沉淀、免疫荧光抗体技术等，可,对目的基因表达的蛋白进行定性，甚至定量检测,。,基因工程的最终目的是在一个,合适的系统,中，使,外源基因高效表达,，从而产生有重要价值的,蛋白质,产品。,其过程包括外源基因克隆，外源基因在宿主细胞中经转录、翻译、加工等过程表达相应蛋白以及蛋白产物的分离纯化等过程。,（六）克隆基因的表达,目前世界范围内开发的基因工程多肽,药物,、,疫苗,、,抗体,有500多种,E.coli,是当前采用最多的,原核表达体系,，运用,E.coli表达有用的蛋白质必须使构建的,表达载体,符合下列标准：,含大肠杆菌适宜的,选择标志,具有能调控转录、产生大量,mRNA的,强启动子,含适当的,翻译控制序列,含有合理设计的,多克隆位点,，以确保目的基因按一定,方向与载体正确连接。,外源基因在原核细胞中的表达,E.coli表达体系在实际应用中,不足之处,：,缺乏转录后加工机制,，,E.coli表达体系只能表达克隆,的,cDNA,，,不宜表达真核基因组DNA,缺乏适当的翻译后加工机制,，,E.coli表达体系的真核,蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰,表达的蛋白质常常形成,不溶性的包涵体,很,难,在,E.coli表达体系中,表达大量的可溶性蛋白质,外源基因在真核细胞中表达,目前常用的,真核表达体系,有酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达体系。,利用真核细胞作为基因的表达体系已被证明具有许多原核表达体系所不具备的优势,不仅可以表达克隆的,cDNA,也可表达真核,基因组,DNA,识别和去除内含子,经,剪接加工,形成成熟的mRNA,对蛋白进行,翻译后加工,最大限度地保证蛋白质的,生物学活性,三、DNA重组技术对医学和生命科学发展的贡献,对人类遗传信息的认识,基因工程药物与疫苗,转基因动物和植物,基因诊断与基因治疗,镰刀型红细胞贫血,Chehab等设计一对引物把含有突变的DNA片段（共294bp）扩增，扩增产物用限制性内切酶 O,xa,N I消化，琼脂糖凝胶电泳后染色观察：,正常人有2个片段，191 和 103bp，,镰刀状红细胞贫血的,纯合子,，仅有一个片段294bp,杂合子,有191、103和294bp 3个片段,思考题,一、基本概念,DNA重组技术,限制性核酸内切酶,回文结构,目的基因,基因组DNA文库,cDNA,文库,-互补,二、简述题,1.何谓基因重组技术，简述其基本过程。,2.何谓目的基因，有哪些来源？,3.解释基因载体，哪些DNA 可作为基因载体？,4.E.coli,表达体系和真核表达体系各自的优、缺点。,