分子生物学-Nov10.ppt

,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,目录,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,DNA,重组和重组,DNA,技术,DNA Recombination and,Recombinant DNA technology,DNA,重组,（,DNA recombination,）是指不同,DNA,分子断裂和连接而产生,DNA,片段的交换并重新组合形成新,DNA,分子的过程。,重组,DNA,技术,（,recombinant DNA technology,）是指在体外将两个或两个以上,DNA,分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新,DNA,分子的过程。,第一节,自然界,DNA,重组和基因转移,DNA Recombination,and Gene Transfer in Nature,DNA,重组,同源重组,(homologous recombination),位点特异的重组,(site-specific recombination),转座重组,(transposition recombination),接合作用,(conjugation),转化作用,(transformation),转导作用,(transduction),发生在同源序列间的重组称为,同源重组,(homologous recombination),，,又称,基本重组（,general recombination,）,。是最基本的,DNA,重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个,DNA,分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,以,E.coli,的同源重组为例，了解同源重组机制的,Holliday,模型,一、同源重组是最基本的,DNA,重组方式,Holliday,模型的,4,个关键步骤：,两个同源染色体,DNA,排列整齐；,片段重组体,(patch recombinant),拼接重组体,(splice recombinant),一个,DNA,的一条链断裂、并与另一个,DNA,对应的链连接，形成,Holliday,中间体；,通过分支移动产生异源双链,DNA,；,Holliday,中间体切开并修复，形成两个双链重组体,DNA,，分别为：,内切酶,(recBCD),DNA,侵扰,(recA),分支迁移,(recA),内切酶,(recBCD),DNA,连接酶,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,3,3,5,3,5,3,3,5,5,3,5,3,5,3,Holliday,中间体,5,3,5,3,5,3,5,3,Holliday,中间体,5,3,5,3,5,3,5,3,5,5,3,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,5,5,5,5,3,3,3,3,内切酶,(ruvC),内切酶,(ruvC),DNA,连接酶,DNA,连接酶,片段重组体,拼接重组体,二、位点特异重组是发生在特异位点间的,DNA,整合,位点特异重组,(site-specific recombination),是由整合酶催化，在两个,DNA,序列的特异位点间发生的整合。,噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒,cDNA,的,长末端重复序列,(long terminal repeat,LTR),。,（一）,噬菌体,DNA,的整合,（二）免疫球蛋白基因的重排,免疫球蛋白,(Ig),，由两条轻链,(L,链,),和两条重链,(H,链,),组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链,(,和,),，一个编码重链。,轻链的基因片段：,重链的基因片段：,L V J C,L V,D,J C,重链,(IgH),基因的,V-D-J,重排和轻链,(IgL),基因的,V-J,重排均发生在特异位点上。在,V,片段的下游，,J,片段的上游以及,D,片段的两侧均存在保守的重组信号序列,(recombination signal sequence,RSS),。此重排的重组酶基因,rag(recombination activating gene),共有两个，分别产生蛋白质,RAG1,和,RAG2,。,CACAGTG(12/23)ACAAAAACC,GTGTCCAC TGTTTTTGG,重组信号序列,基因片段,免疫球蛋白基因重排过程,三、转座重组,可使基因移位,由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为,转座,(transposition),。,大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的,DNA,序列包括插入序列和转座子。,插入序列,(insertion sequences,IS),组成：,IR,Transposase Gene,IR,（一）插入序列转座,二个分离的反向重复,(inverted repeats,IR),序列,特有的正向重复序列,一个转座酶（,transposase),编码基因,插入序列的复制性转座,转座子,(transposons),可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。,IR,IR,Transposase Gene,有用基因,（二）转座子转座,转座子组成：,反向重复序列,转座酶编码基因,抗生素抗性等有用的基因,细菌的可流动性元件,A,插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列,(,箭头所示,),B,转座子,Tn3,：含有转座酶、,-,内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因,C,转座子,Tn10,：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列,IS10L,由转座子介导的转座,Barbara McClintock,(19021992),DNA transposable element,Nobel Prize in Physiology or Medicine 1983,第二节 重组,DNA,技术,Recombinant DNA Technology,重组,DNA,技术的发展史,1865,年,G.J.Mendel,的豌豆杂交试验。,1944,年,O.T.Avery,的肺炎球菌转化实验。,1973,年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组,DNA,分子。,1977,年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组,DNA,技术制造医学上重要的药物。,1980,年 开始建造第一家应用重组,DNA,技术生产胰岛素的工厂。,1997,年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,重组,DNA,技术相关概念,克隆,(clone):,来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化,(cloning),，即无性繁殖。,DNA,克隆,技术水平：,分子克隆,(molecular clone),（即,DNA,克隆）,细胞克隆,个体克隆（动物或植物）,Dolly,(19962003),Dolly and Bonnie,1996,First mammal cloned from adult cells,其主要过程包括：在体外将目的,DNA,片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组,DNA,分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一,DNA,分子的大量拷贝。,重组,DNA,技术，又称分子克隆（,molecular cloning,）或,DNA,克隆（,DNA cloning,）或基因工程（,genetic engineering,）技术,目的：,分离获得某一感兴趣的基因或,DNA,获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,一、重组,DNA,技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,聚合酶,逆转录酶,T,4,DNA,连接酶,碱性磷酸酶,末端转移酶,Taq,DNA,聚合酶,for the discovery of,restriction enzymes,and their application to problems of molecular genetics,Werner Arber,Daniel Nathans,Hamilton O.Smith,Switzerland,Biozentrum der Universitt,Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore,USA,Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore,USA,（,1929,）,（,1928 1999,）,（,1931,）,发现限制与修饰现象；分离出,I,型内切酶,分离出,II,型内切酶,用,II,型内切酶切割,DNA,Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978,重组,DNA,技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割,DNA,DNA,连接酶,催化,DNA,中相邻的,5,磷酸基和,3,羟基末端之间形成磷酸二酯键，使,DNA,切口封合或使两个,DNA,分子或片段连接,DNA,聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接；,缺口平移制作高比活探针；,DNA,序列分析；,填补,3,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA,第二链合成，双链,DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,；,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5,羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在,3,羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,限制性核酸内切酶,(,restriction endonuclease),限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是一类核酸内切酶，能识别双链,DNA,分子内部的特异序列,并裂解磷酸二酯键。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,定义：,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源,DNA,，保护自身,DNA,。,、,、,（基因工程技术中常用,型）,分类：,作用：,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,类酶识别序列特点,回文结构,(palindrome),切口：,平端切口,、,粘端切口,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,黏端切口,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端,(compatible end),。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,同尾酶,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称,同裂酶或同功异源酶,。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,同裂酶：,名称 识别序列及切割位点,名称识别序列及切割点,切割后产生突出末端,:,BamH,5,G,GATCC.3,Bgl,5,A,GATCT.3,EcoR,5,G,AATTC.3,Hind,5,A,AGCTT.3,Hpa,5,C,CGG.3,Mbo,5,GATC.3,Nde,5,GA,TATG.3,切割后产生,3,突出末端,:,Apa,5,GGGCC,C.3,Hae,5,PuGCGC,Py.3,Kpn,5,GGTAC,C.3,Pst,5,CTGCA,G.3,Sph,5,GCATG,C.3,切割后产生平末端,:,Alu,5,AG,CT.3,EcoR,5,GAT,ATC.3,Hae,5,GG,CC.3,Pvu,5,CAG,CTG.3,Sma,5,CCC,GGG.3,限制性内切核酸酶,二、重组,DNA,技术中常用的载体,定义,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,载体按功能分为,克隆载体,(cloning vector),表达载体,(expression vector),克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被扩增而特意设计的载体称为,克隆载体,。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为,表达载体,。,（一）克隆载体,至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行,自主复制,，并能使克隆的外源,DNA,片段得到同步扩增；,至少有,一个选择标志,（,selection marker,）：选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性基因、,-,半乳糖苷酶基因（,lacZ,）、营养缺陷耐受基因等。,有适宜的,RE,的单一切点,：载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个,RE,的单一切点，可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（,multiple cloning sites,，,MCS,）。,1.,克隆载体应具备的基本特点,（,1,）质粒,(plasmid),特点,:,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,2.,常用的克隆载体,pUC18,质粒载体图谱,噬菌体,DNA,改造系统,gt,系列（插入型，适用,cDNA,克隆）,EMBL,系列（置换型，适用基因组克隆）,（,2,）噬菌体,(phage),M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因）,M13mp,系列,pUC,系列,柯斯质粒,（,cosmid,）,载体（又称黏粒载体）,酵母人工染色体,(yeast artificial chromosome,YAC),细菌人工染色体,(bacterial artificial chromosome,BAC),动物病毒,DNA,改造的载体,（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,（,3,）其他克隆载体,（二）表达载体,表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。,根据宿主细胞分为：,原核表达载体,真核表达载体,1.,原核表达载体,原核表达载体的基本组成,R,：调节序列；,P,：启动子；,SD,：,SD,序列；,TT,：转录终止序列,2.,真核表达载体,真核表达载体的基本组成,Ori,Pro,：,原核复制起始序列；,P,：,启动子；,MCS,：,多克隆位点；,TT,：,转录终止序列；,ori,euk,：,真核复制起始序列。,第三节,重组,DNA,技术基本原理,和操作步骤,基本原理,目的基因的获取,DNA,导入受体细胞,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,原核基因组和真核基因组,真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一,人类染色体单倍体,DNA,全长,310,9,bp,，含,3,4,万个基因。,大肠杆菌,DNA,全长,4.6,10,6,bp,，含,4000,个基因。,原核基因组,Prokaryote Genome,基因组通常仅由,一条环状双链,DNA,分子组成。,基因组中,只有,1,个复制起点,。,基因组中的重复序列很少，编码蛋白质结构基因多为单拷贝。,基本结构特点：,启动子（,promoter,）、操纵基因（,operator,）、调控序列、结构基因（,structure gene,）、终止子（,terminator,）。,基因序列是连续的，无内含子结构,连续密码区,mRNA Protein,基本结构：,结构基因（,structural gene,）,指能转录成为,mRNA,、,rRNA,或,tRNA,的,DNA,顺序。,结构基因不连续，编码序列被非编码序列打断，,分割成几段，,编码序列称为外显子,(exon),，,其间的序列称为内含子,(,intron,),称为,断裂基因（,split gene,）。,非编码区,剪切,编码区,编码区,mRNA Protein,真核基因组,Eukaryote Genome,intron,exon,exon,有大量重复序列,获取目的基因常常是基因操作的首要步骤。,化学合成法,基因文库法（或,cDNA,文库法）,PCR,法,获取目的基因,较短的基因（,60-80bp,）,用途：,PCR,引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针,化,学,合,成,法,构建不同的基因文库,通过核酸杂交的筛选,或通过抗原抗体反应的筛选,基,因,文,库,法,获取目的基因,Genome,DNA,片段,重组,DNA,分子,基因文库,内切酶,载体,受体菌,从基因文库获取目的基因,mRNA,cDNA,双链,cDNA,重组,DNA,分子,cDNA,文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,从,cDNA,文库获取目的基因,聚合酶链反应（,polymerase chain reaction,PCR,）是在体外进行的由引物介导的酶促,DNA,扩增反应。是获取已知序列候选基因的主要方法。,PCR,法,PCR,技术的基本过程,模板,DNA,dNTP,引物,Buffer,预变性,模板,DNA,dNTP,引物,Buffer,TaqDNA,聚合酶,循环仪,94,o,C5,94,55,72,基因重组,基因操作的关键步骤和核心内容,关系到研究的成败或质量,包括：基因分离，基因组合，基因转化，基因筛选,分,:,切,:,限制性内切酶,“,分子手术刀,”,（三）目的,DNA,与载体连接,方式：（,1,）,单一相同黏端连接,（,2,）,不同黏端连接,（,3,）,通过其他措施产生黏端进行连接,黏端连接,Bam,H,切割反应,GGATCC,CCTAGG,T4,DNA,连接酶,15,C,GATCC,G,G,CCTAG,+,目的基因用,Bam,H,切割,载体,DNA,用,Bam,H,切割,重组体,载体自连,目的基因自连,单一相同黏端连接,不同黏端连接（定向克隆）,Eco,R,切割位点,Bg,l,切割位点,+,Eco,R+,Bg,l,双酶切,Eco,R+,Bg,l,双酶切,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接,。,人工接头,(linker),连接,通过其他措施产生黏端进行连接,在末端转移酶,(terminal transferase),的作用下，在,DNA,片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,同聚物加尾连接,5,3,3,5,载体,DNA,5,3,3,5,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5,3,3,5,5,3,T(T),n,T,T(T),n,T,3,5,5,3,3,5,3,A(A),n,A,A(A),n,A,3,5,-,核酸外切酶,-,核酸外切酶,末端转移酶,+,dATP,末端转移酶,+,dTTP,T(T),n,T,A(A),n,A,A(A),n,A,T(T),n,T,T4,DNA,连接酶,15,C,重组体,5,PCR,法加入,RE,位点,针对目的,DNA,的,5,-,和,3,-,端，设计一对特异引物，在每条引物的,5,-,端分别加上不同的,RE,位点，然后以目的,DNA,为模板，经,PCR,扩增便可得到带有引物序列的目的,DNA,，再用相应,RE,切割,PCR,产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。,平端连接,限制性内切酶切割产生的平端,粘端补齐或切平形成的平端,适用于：,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA,连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,3.,粘,-,平末端连接,黏,-,平末端连接是指目的,DNA,和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。,属于定向克隆,受体菌条件：,安全宿主菌,限制酶和重组酶缺陷,处于感受态,(competent),导入方式：,转化,(transformation),转染,(transfection),感染,(infection),（四）重组,DNA,转入受体细胞,转,1.,借助载体上的遗传标志进行筛选,(1),利用抗生素抗性标志筛选,(2),利用基因的插入失活,/,插入表达特性筛选,(3),利用标志补救筛选,(4),利用噬菌体的包装特性进行筛选,（五）重组体的筛选与鉴定,筛,2.,序列特异性筛选,(1),RE,酶切法,(2),PCR,法,(3),核酸杂交法,(4)DNA,测序法,3.,亲和筛选法,插入失活筛选带有重组载体的克隆,互补筛选（蓝,-,白筛选）,菌落或噬斑原位杂交筛选重组体,重组,DNA,技术操作过程可形象归纳为：,小结,分,分离获取目的基因,选,载体的选择与构建,接,目的,DNA,与载体连接,转,重组,DNA,转入受体细胞,筛,重组体的筛选与鉴定,表达体系的建立：,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,标准：,选择标志 强启动子,翻译调控序列多接头克隆位点,E.coli,表达体系的不足,：,不宜表达真核基因组,DNA,；,不能加工表达的真核蛋白质；,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体,(inclusion body),；,很难表达大量可溶性蛋白。,1.,原核表达体系,(E.coli,表达体系最为常用,),优点：,可表达克隆的,cDNA,及真核基因组,DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,缺点：,操作技术难、费时、经济,转染,将表达载体导入真核细胞的过程,方法：,磷酸钙转染,DEAE,葡聚糖介导转染,电穿孔,脂质体转染,显微注射,2.,真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）,第三节,重组,DNA,技术在医学中的应用,Application of Recombinant DNA Technology in Medicine,一、重组,DNA,技术广泛应用于生物制药,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为,21,世纪的支柱产业。,美国,Eli Lilly,公司于,1982,年首先利用重组,DNA,技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有,50,多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。,重组,DNA,医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子,VIII,促进凝血,颗粒细胞,-,巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子,(bFGF,EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素,(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及某些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗,(CHO,酵母,),预防乙肝,口服重组,B,亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,二、重组,DNA,技术还应用于医学的其他诸多方面,疾病相关基因的发现与鉴定,转基因和基因打靶,加速了人类基因组计划的完成,疾病的基因诊断和基因治疗,What genes are?,How they act?,