HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解培训课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,*,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,1.,流动相的一般要求,流动相对样品具有一定的溶解能力,流动相具有一定惰性,流动相应不改变填料的任何性质,纯度高,流动相的黏度要尽量小,流动相的物化性质要与使用的检测器相适应,流动相沸点不要太低,应选用挥发性溶剂,流动相配置好后要进行过滤,流动相配制好后要进行脱气,2,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,2.,常用溶剂的重要性质,极性,黏度,沸点,紫外截止波长,3,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,常用溶剂参数表,Solvent,Polarity,Viscosity(cp20),Boiling Point(),UV CutOff(nm),Hexane(,正己烷,),0.06,0.33,69,210,Carbontetrachloride(,四氯化碳,),1.60,0.97,77,265,Toluene(,甲苯,),2.40,0.59,111,285,Benzene(,苯,),3.00,0.65,80,210,Methylenechloride(,二氯甲烷,),3.40,0.44,40,245,n-propanol(,异丙醇,),4.00,2.27,98,210,Tetrahydrofuran(,四氢呋喃,),4.20,0.55,66,220,Ethanol(,乙醇,),4.30,1.20,79,210,Chloroform(,氯仿,),4.40,0.57,61,245,Acetone(,丙酮,),5.40,0.32,57,330,Acetonitrile(,乙腈,),6.20,0.37,82,190,Dimethylformamide(,二甲基甲酰胺,),6.40,0.92,153,270,Methanol(,甲醇,),6.60,0.60,65,205,Ethyleneglycol(,乙二醇,),6.90,19.90,197,210,Dimethylsulfoxide(,二甲亚砜,),7.20,2.24,189,260,Water,10.20,1.00,100,210,4,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,3.,过滤,溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。,色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。,仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。,5,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,5.,溶剂过滤器的防护,溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。,（,1,）严格执行溶剂过滤,（,2,）勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液,（,3,）避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。,堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（,35%,）中浸泡,1h,，然后用蒸馏水冲洗干净。,7,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,6,流动相的贮存,流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器内,，不要贮存在塑料容器中。,贮存容器一定要盖严,，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧及尘埃溶入流动相。,磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存,超过规定的有效期。,容器应定期清洗,，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。,8,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,7,HPLC,实验用水,HPLC,实验用水除满足药典对纯化水,一般要求外，还需要满足以下要求：,项目,指标,电阻率，,Mcm,，,25,，最小,18.0,总有机碳（,TOC),，,mg/L,，最大,0.5,微粒，,m,滤器,0.22,HPLC,级水增加紫外加吸收要求：,在,1cm,池中，用,HPLC,级水作空白，在,190nm,、,200nm,和,250400nm,的吸收度分别不得过,0.01,、,0.01,和,0.05,。,9,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,8.,等度洗脱,在反相色谱中，极性越强的溶剂洗脱能力越弱。,等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，组分极性有一定差别的样品，多用于含量测定。,优点：基线平稳，保留时间重现性好，对流动相纯度要求低。,缺点：较早洗脱出的色谱峰时分离度差，较晚洗脱出的色谱峰展宽理论塔板数低。,10,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,9.,梯度洗脱,梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和,pH,值等，用于分析组分数目多样品。,优点：,缩短分析时间,提高分离度,改善峰形,提高检测灵敏度,缺点：,增加基线漂移,较长平衡时间,11,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,9.,梯度洗脱,在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：,要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。,梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高,混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。,要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。,每次梯度洗脱之后必须,1030,倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使其恢复到初始状态。,12,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,10,流动相的,pH,值,反相离子抑制技术：,采用反相色谱法分离弱酸或弱碱样品时，通过调节流动相的,pH,值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术。,对于弱酸，流动相的,pH,值越小，组分的解离平衡常数,Ka,值越小，当,pH,值远远小于弱酸的,pKa,值时，弱酸主要以分子形式存在；,对弱碱，流动相的,pH,值越大，组分的,Ka,值越大，当,pH,值远远大于弱碱的,pKa,值时，弱碱主要以分子形式存在；,分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用,10,50mmol/L,磷酸盐缓冲液，,0.05%TFA,；,分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用,10mmol/L,三乙胺溶液，,0.050.5%NH4OH,。,13,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,10,流动相的,pH,值,当溶液,pH,值等于化合物的,pKa,时，化合物半解离。,在,pKa1.5,的范围内，保留随,pH,值的变化而发生明显变化。,超过此,pH,值范围，化合物完全解离或不解离，保留随,pH,值的变化很小。,了解化合物的,pKa,值，可在,pKa2,的范围外调节流动相的,pH,值，使化合物有较好的峰形，保持保留的恒定，使建立的方法具有耐用性。,14,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,10,流动相的,pH,值,15,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,11.,缓冲盐,HPLC,用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。,在线,Seal-wash,选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。,清洗液配制,:90%,水,+10%,异丙醇,.,该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。,当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，因此此时应该在进液口位于混合器下方放置含盐流动相进液口位于混合器上方放置不含盐流动相；,16,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,11.,缓冲盐,缓冲剂,pKa,缓冲范围,UV,截止波长,nm,磷酸盐,2.1,1.1-3.1,200(0.1%),7.2,6.2-8.2,12.3,11.3-13.3,柠檬酸盐,3.1,2.1-6.4,230(10mM),4.7,5.4,甲酸盐,3.8,2.8-4.8,210(10mM),乙酸盐,4.8,3.8-5.8,210(10mM),氨水,9.2,8.2-10.2,200(10mM),三乙胺,11,10.0-12.0,200(10mM),17,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,12.,离子对试剂,作用原理：,离子对试剂与待分析的物质（多为在溶液状态时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性，这样非极性就表现出来，从而在色谱柱上有保留行为。,试剂选择：分析,酸性,（作用基团）,样品,一般,用,阳,离子对试剂,（,四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵,）,，分析碱性样品用,阴,离子对试剂,（,己烷磺酸钠,、辛,烷磺酸钠,十二烷基磺酸钠,）,离子对的分离机制,-,离子对模型,样品离子首先在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的疏水性离子对，然后溶解或吸附于非极性固定相上。离子对试剂的烷基,C,链越长，生成的离子对与固定相的亲和力越大，因此组分的保留值也越大。,使用,离子对,试剂,浓度尽可能的低,（一般,0.005mol/L),，,以,保证对柱子填料的稳定性影响最小及清洗方便。,18,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,12.,离子对试剂,离子对试剂,使用,注意的因素有,：,1,、,离子对的浓度，这个一般情况下在满足要求的前提下,越低越好,。,2,、,离子对,溶液,的,pH,，这个是进行分离的最关键的因素，而只能在缓冲液中测定,pH,不要混合,有机相后,测定,。,3,、,如果使用离子对试剂，一定注意平衡时间，正常的话在,60-90,分钟才能达到彻底的平衡，还有在实验结束以后要冲洗超过,2,个小时,，否则,柱子,可能,会不可逆的损伤。,4,、,用离子对,进行,实验所用的柱子,尽量,和其他的非离子对的分开,使用。,19,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,13.,各种检测器对流动相的特殊要求,13.1 UV,：,截止波长,:,将溶剂装入,1cm,的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度,A,1,时的波长。,中国药典对,UV,法溶剂的要求是：,以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度：,在,220240nm,范围内不得超过,0.40,在,241250nm,范围内不得过,0.20,在,251300nm,范围内不得过,0.10,在,300nm,以上不得过,0.05,20,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,13.,各种检测器对流动相的特殊要求,13.2 ELSD,ELSD,对流动相的组成不敏感，可以用于梯度洗脱；,ELSD,要求流动相要蒸发掉，因此不能使用不易挥发的物质来调节流动相的,pH,值。,21,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,13.,各种检测器对流动相的特殊要求,13.3 MSD,由于盐对质谱的损伤很大，故在流动相的选择上，,需避免使用不可挥发性盐，尽量少使用可挥发性盐,。故一般离子对色谱和离子抑止色谱方法的流动相是不能直接用到液质上的。,对于,ESI,（电喷雾电离），需要考虑基质效应：,对于正离子模式的方法，流动相的,pH,最好小于,5.0,，以提高离子化效率，通常在流动相中添加,TFA,FA,。,对于负离子模式，,pH,最好大于,8.0,，通常在流动相中添加氨水。,22,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,Thank You!,23,HPLC方法开发流动相的选择医学知识讲解,