生物物理课省公开课一等奖全国示范课微课金奖PPT课件.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,俺怎么越看越象,乒乒乓乓，不要扔西红柿-_-b,俺们进山全家福，hoho,COOH,NH2,第1页,8.膜蛋白结构研究,第2页,膜蛋白结构研究,蛋白膜拓扑学研究,蛋白质晶体学研究:X-ray;EM,蛋白质单颗粒研究:EM;AFM,蛋白质结构波谱技术:荧光;,CD;NMR,第3页,膜蛋白结构研究,蛋白膜拓扑学研究,蛋白质晶体学研究:3D;2D,蛋白质单颗粒研究:EM;AFM,蛋白质结构波谱技术,第4页,蛋白膜拓扑学,(membrane protein topology),蛋白质序列中跨膜区段，即蛋白质哪些部位插入膜内,蛋白质在膜上整体取向，普通即蛋白质哪一端位于细胞膜外侧，哪一端位于细胞膜内侧，以及各部分之间相对取向,第5页,蛋白膜拓扑学研究,膜蛋白拓扑取向基本原理,蛋白膜拓扑学研究惯用方法,影响蛋白拓扑取向原因,第6页,膜蛋白拓扑取向基本原理,疏水性标准,视紫红质蛋白嗜水性分析图谱。图谱表明该蛋白存在,7,个大片疏水区域，由此得出视紫红质,7,次跨膜结论,第7页,膜蛋白拓扑取向基本原理,正电氨基酸朝内,标准,对已知结构细菌内膜蛋白统计发觉，带正电氨基酸普通位于朝向胞质侧（,cytoplasmic,），即大部分带正电菏残基在转运过程中都不能被转运过膜。,只有对长度较短蛋白片断，正电残基朝内标准才成立（普通不超出60氨基酸），而且在这个范围内，正电氨基酸出现在膜内侧百分比伴随片断长度增加而降低,第8页,依据,35,个细菌内膜蛋白统计结果，胞质腔蛋白,loop,区与周质腔蛋白,loop,区中正电荷氨基酸,(Lys,和,Arg),所占百分比比较,(A),；以及胞质腔蛋白,loop,长度与周质腔蛋白,loop,长度分布,(B),。,其中，黑色表示蛋白胞质区片断,(cytoplasmic loop),而白色表示蛋白周质腔片断,(periplasmic loop),，横坐标为,loop,长度。,正电氨基酸朝内,标准,第9页,蛋白膜拓扑学研究,膜蛋白拓扑取向基本原理,蛋白膜拓扑学研究惯用方法,影响蛋白拓扑取向原因,第10页,蛋白膜拓扑学研究惯用方法,理论分析,：蛋白质嗜水性分析,试验分析：,蛋白水解法,免疫方法,化学标识法,特殊部位定位法,融合蛋白法,第11页,蛋白膜拓扑学研究惯用方法,理论分析,：蛋白质嗜水性分析,关于疏水作用,疏水物质在水中聚集熵增加是自发过程！,dS 0 贡献是主要！dH,0 minimal！,当一个疏水性分子（与水分子之间不能形成更强氢键）进入水相时，因为影响系统自由能主要是熵变过程，外来分子会发生聚集，以尽可能降低其周围有序水分子数目。表观上看，好象有一个力（疏水力）作用使它们结合到了一起。,第12页,关于疏水作用,K.Kauzmann(1959)研究非极性残基从非极性溶剂转移至水中热力学性质.,模型系统：非极性分子,甲烷,(CH,4,),非极性溶剂,苯或CCl,4,问题提出：X mole 甲烷从CCl4中移至水中free energy 怎样改变？,由dG=dH TdS,转移过程：dH(enthalpy)0 放热造成 dG降低,dS(entropy)0 贡献是主要！dH,0 minimal！,第13页,蛋白质嗜水性分析,当溶质在疏水性溶剂及水中溶解度已知时，溶质从疏水性溶剂转移到水相中化学势改变,G,t,能够求知，这个参数常被用来来描述溶质嗜水性。,G,t,=RTln（N,nh,/N,h,）,N,nh,、N,h,分别为溶质在疏水性溶剂和水中饱和溶解度,第14页,可用氨基酸残基从疏水性溶剂转移到水相转移自由能,G来描述该侧链嗜水性。,依据热力学公式，溶质在水中化学势,h,为：,h,=u,h,0,+RTlnx,h,+RTlnf,h,其中，x,h,是以溶质摩尔分数为单位，,h,0,为此时溶质在水中标准化学势，f,h,为活度系数。,在疏水性溶剂中，类似有：,nh,=u,nh,0,+RTlnx,nh,+RTlnf,nh,其中，x,nh,u,nh,0,和f,nh,分别是在疏水性溶剂中溶质摩尔分数，标准化学势和活度系数。,现定义溶质从疏水性溶剂转移到水相中转移自由能,G,t,为无限稀释溶液中一样溶质摩尔分数从疏水性溶剂转移到水相中化学势改变，则,G,t,为,G,t,=u,h,0,-u,nh,0,又当同一溶质在各种溶剂中饱和溶解时，化学势皆相等，故：,u,h,0,+RTlnN,h,+RTlnf,h,=u,nh,0,+RTlnN,nh,+RTlnf,nh,其中，N,nh,、N,h,分别为溶质在疏水性溶剂和水中饱和溶解度，所以：,G,t,=RTln（N,nh,/N,h,）+RTln（f,nh,/f,h,）,忽略溶质分子之间相互作用，则有：,G,t,=RTln（N,nh,/N,h,）,由此能够得出结论，当溶质在疏水性溶剂及水中溶解度已知时，溶质从疏水性溶剂转移到水相中化学势改变,G,t,能够求知，这个参数常被用来来描述溶质嗜水性。,第15页,蛋白质嗜水性分析,蛋白质疏水性分析图作法：,有了每个氨基酸残基侧链嗜水性值，经过计算机,能够,作出一个蛋白质疏水性分析图。,需要注意是，蛋白质疏水性分析图中每个氨基酸对应嗜水性值并非该独立氨基酸侧链嗜水性值，而是以该氨基酸为中心一小段肽链嗜水性值平均，这是因为在蛋白质中，某点疏水性情况显然要受到周围残基侧链影响，普通区段长度选7、9、11或13个氨基酸均能取得理想结果。,第16页,蛋白膜拓扑学研究惯用方法,理论分析,：蛋白质嗜水性分析,试验分析：,蛋白水解法,免疫方法,化学标识法,特殊部位定位法,融合蛋白法,第17页,蛋白水解法,将含有要研究蛋白生物膜制成取向一致,脂质体（如,Inside out Vescicle,）,加入蛋白水解试剂（如,Trypsin,、,Thermolysin,等）,加入抑制剂终止反应,去垢剂溶解膜,SDS,PAGE,电泳,片断分析,第18页,蛋白水解法,试验中还需要注意：,蛋白水解抑制剂必须有效，有些蛋白酶极难被抑制，而且加入去垢剂后依然保持活性，这么膜蛋白全部被水解，得不到结果；,可选取各种水解试剂试验，综合所得信息，另外，当试验出现阴性结果时，并不能说明蛋白没有膜外片断，只能说明蛋白没有膜外部分或有膜外部分但该部分没有水解位点；,在电泳检测方面，假如所研究蛋白本身占所用膜上蛋白总量大部分，则可直接分析各主要电泳带；但若是研究蛋白只占膜蛋白总量小部分，则必需用单抗或特殊共价标识物来找出正确电泳带分析。,第19页,蛋白膜拓扑学研究惯用方法,理论分析,：蛋白质嗜水性分析,试验分析：,蛋白水解法,免疫方法,化学标识法,特殊部位定位法,融合蛋白法,第20页,免疫方法:,免疫技术基本思想是使处于脂质体内部片断受到保护不与外界接触而膜外部分不受保护。因为使用特异性单抗而使试验结果分析相对简单。惯用方法是将单抗首先进行同位素标识，反应完成以后将产物电泳然后进行放射性自显影，依据显影带位置判断抗体是否与蛋白结合。另外假如使用胶体金标识抗体与蛋白结合后电镜观察，就能够看到其结合部位。,这种方法依然含有很大不足，主要是不能确保抗短肽单抗一定能和对应蛋白序列结合，因为该部分序列可能受蛋白质其它部分影响而采取与短肽完全不一样构象，或者根本就被其它部分包埋而不能被接触。,第21页,蛋白膜拓扑学研究惯用方法,理论分析,：蛋白质嗜水性分析,试验分析：,蛋白水解法,免疫方法,化学标识法,特殊部位定位法,融合蛋白法,第22页,化学标识法：,经过蛋白上特殊氨基酸能否被位于特定部位化学标识物标识，能够判断该残基所处位置。惯用化学标识试剂主要分两大类，即极性试剂和非极性试剂，极性试剂普通认为不能过膜，位于脂质体外，所以能够与蛋白质位于水相部分反应。而非极性试剂则能插入膜内将蛋白位于膜内残基化学标识。通常我们事先将化学标识物带上放射性同位素，所以在反应完成以后能够经过放射性自显影来判断蛋白是否与化学标识物发生了反应。,该法缺点在于必须确保化学标识物所处位置正确性，而且有标识物能使脂质体发生泄漏影响试验结果。尤其对于碘化试剂，因为试验过程中可能产生游离I,2,，I,2,能透膜使试验结果失去意义。,第23页,蛋白膜拓扑学研究惯用方法,理论分析,：蛋白质嗜水性分析,试验分析：,蛋白水解法,免疫方法,化学标识法,特殊部位定位法,融合蛋白法,第24页,特殊部位定位法：,蛋白上特殊部位相对膜位置往往含有主要意义。如糖蛋白糖基化位点通常位于细胞膜外侧，所以经过寻找蛋白质序列上糖基化位点可基本判断该段序列位于细胞膜外侧；一样，经过修饰酶在细胞中位置可推知对应修饰位点位于膜哪一侧，如磷酸化酶位于细胞基质内，所以膜蛋白上磷酸化位点一定位于朝向胞质一面。这项技术曾被成功地应用于E.Coli外膜蛋白OmpA、LamB拓扑取向研究，这两种蛋白上都含有与细菌噬菌体结合位点，经过突变体与噬菌体亲和性研究可找到结合位点位置，从而判断该段序列位于细胞外膜外侧。,这项技术缺点在于不足较大，应用面不广。,第25页,融合蛋白法:,近年来伴随分子生物学技术发展，基因融合方法越来越多地被应用到了蛋白质膜拓扑取向研究中来。该方法基本原理是：在原蛋白编码基因一端加上一段报导基因（reporter gene），这么编码产物为原蛋白与一个报导蛋白连接嵌合蛋白.,报导蛋白是经过精心选择，它们含有一定生化活性，而且该活性依赖于其在细胞中所处特定位置，也就是只有当蛋白质处于特殊细胞部位时才有生化活性。这么依据报导蛋白活性有没有能够得知它在细胞中所处位置，从而推知与其相连接原蛋白片断所处位置。,第26页,蛋白膜拓扑学研究,膜蛋白拓扑取向基本原理,蛋白膜拓扑学研究惯用方法,影响蛋白拓扑取向原因,第27页,实际上，当前关于影响蛋白质拓扑取向原因研究主要是指哪些原因影响蛋白质在膜上整体取向，即哪一端朝膜内，哪一端朝膜外。因为我们知道，蛋白质插膜部分基本上是由蛋白质本身序列疏水性决定，受外部原因影响不大。不过插膜部分确定后蛋白质膜上取向依然有两种可能，这两种取向恰好颠倒,。,影响蛋白拓扑取向原因,第28页,研究方法：,当前研究材料普通选取,Inner membrane protein leader peptidase,（,Lep,）及其突变体。这是一个,E.Coli,内膜蛋白，在内膜上跨膜两次，,N,端、,C,端均朝向周质腔（,periplasm,）一面。改变条件，这个蛋白在膜上拓扑取向可能完全翻转，即造成,N,端、,C,端都朝向细胞质（,cytoplasm,）。因为其,C,端存在,Trypsin,酶切位点，所以可经过酶解试验来判断蛋白构象是否发生了翻转，即假如蛋白未发生翻转则外加蛋白酶,Trypsin,能够将蛋白水解，但发生翻转将造成酶切位点进入细胞质而无法与蛋白酶接触。依据蛋白水解部分所占百分比我们还能够定量测知翻转构象所占百分比。,第29页,影响蛋白拓扑取向原因,信号肽,跨膜电位,膜上负电脂所占百分比,第30页,信号肽影响,许多蛋白在刚被合成时,N,端多出一条短肽，称,“,信号肽,”,，长度,15,25,氨基酸，多带正电荷。当前关于信号肽研究表明它可能有各种功效。首先是阻止初生肽链过早折叠成型，使蛋白处于无规卷曲状态以利转运；其次是与膜上特殊受体结合实现蛋白质选择性跨膜转运。另外，最近研究,表明，信号肽在保持蛋白质正确拓扑取向方面也有很主要作用，这一作用实现是因为信号肽多带正电荷，而正电荷富集区域极难被转运过膜来，从而确保了蛋白质只能选择信号肽朝内拓扑取向,第31页,跨膜电位,Andersson,等人研究了跨膜电位,+,对,Lep,拓扑取向影响，其试验思绪基本以下：构建,Lep,突变体，在其,N,端引入四个正电残基以强化正电荷原因影响。使用,Trp,水解试验测定其翻转构象所占百分比。当加入消除膜电位试剂,CCCP,重复上述试验时，发觉采取翻转构象百分比显著降低，说明正电朝内标准是依赖于膜电位。这一点从直观上也是比较轻易了解，因为正常细胞都含有内负跨膜电位，从能量上讲正电荷富集区域位于内侧也是有利。,第32页,膜上负电脂所占百分比,Kruijff,等人研究了生物膜上负电脂所占百分比对蛋白质拓扑取向影响，其试验对象依然是,Lep,蛋白。他们首先构建了,E.Coli,突变株,HDL11,，在该突变株中，,psg,基因前加入了一个,Lac promoter,。,psg,基因编码蛋白是合成负电磷脂必须一个主要酶，在引入,promoter,以后该基因表示将受到,IPTG,诱导调控。在加入,IPTG,情况下，基因正常表示，细菌内膜上含有正常百分比负电脂（,PG16,，,CL3,）；而不加,IPTG,时，基因基本上不表示，负电磷脂合成受到影响。试验表明,PG,含量下将至,2,，,CL,含量下将至,1,，即使细胞会经过一些其它路径使酸性磷脂含量略增，但总来说，负电脂所占百分比不超出,9,。在这种情况下，再利用,N,端增加了四个正电残基,Lep,突变体试验，发觉加入,IPTG,时，翻转构象百分比较大，而不加,IPTG,时，翻转构象百分比下将。这说明，正电朝内标准是依赖于生物膜上酸性磷脂所占百分比,第33页,登顶成功，可惜神仙都被一脸幸福地俺们吓跑了。,膜分子生物学,游击队,第34页,