液相色谱实用技术_色谱柱的使用及保养.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,液相色谱实用技术,色谱柱的使用及保养,良好的色谱实验习惯,拿到一根新色谱柱时，先测柱效,保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件,定期检测柱效,定期检测仪器的谱带展宽,色谱柱的使用及操作,流动相的转换,流速,(,压力,),的变化幅度,温度的变化幅度,专用色谱柱样品及溶剂的要求,色谱柱的保养（一）,样品方面,除去微粒及杂质,了解样品在流动相中的溶解度,如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出,了解样品与色谱柱的基质,/,填料是否相互作用,色谱柱的保养（二）,流动相方面,除去微粒,纯度的要求,超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低,缓冲液的,pH,值，在填料的允许范围内,缓冲液（盐）的浓度,溶剂：色谱纯，,溶剂中的杂质含量,流动相对样品的溶解度,有机溶剂或水的比例,在线的保护装置,给色谱柱提供物理的保护,除去样品及流动相中的颗粒,给色谱柱提供化学的保护,防止分析柱被化学污染,装置,在线过滤器,自装填料保护柱,预装保护柱,在线过滤器,In-Line Filter,防止颗粒在色谱柱头累积,优点：基本不影响柱效,在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）,可更换的消耗品,更换滤芯，,更换垫圈，,保护柱,可避免化学污染。多数保护柱影响到整个色谱柱的柱效，特别是在用微柱时,保护柱的种类,普通自装填料的保护柱,用户自装填料,影响柱效同装填技术有关，柱效降低较大,色谱柱的清洗,对所做的样品要有充分的了解,用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗,硅胶柱的一般方法,先用甲醇洗去极性杂质,用干燥的二氯甲烷、正庚烷,100200,ml,依次活化,键合相柱,(,烷基,),的一般方法,20,倍柱体积的：甲醇,-,氯仿,-,甲醇,-,水依次冲洗,色谱柱的存放,存放前的处理,除去杂质、盐,合适的存放溶剂,避免色谱柱床的干枯,避免机械震动,防止细菌生长,色谱柱常见毛病,柱压过高,多少才算高,?,不同色谱柱有差异,不同系统有差异,不同溶剂有差异,柱效低,重复性差,不出峰，回收率低,柱压过高,为什么柱压会过高,微粒堵塞,样品,流动相,密封垫,柱床膨胀,不可逆吸附,细菌生长,柱效低,为什么柱效低,色谱柱被污染,过滤片部分堵塞,样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞,色谱柱内的死体积,流动相,pH,值及组成不合适造成固定相流失,流速急剧变化造成固定相物理损坏,机械震动造成固定相产生裂缝,柱床收缩或干枯,重复性差、回收率低,实验的重复性差,色谱柱被污染,流动相,pH,值及组成不合适造成键合相流失,样品溶剂不同或样品本身不稳定,回收率低，不出峰,“,不可逆,”,吸附,固定相过强或流动相过弱,非特异性吸附,色谱柱以外的因素（一）,“,柱效,”,问题，不一定是色谱柱问题！,仪器问题：连接不好造成死体积,进样器,检测器,管路，连接口,保护柱,在线过滤器堵塞,流动相问题：色谱柱未平衡好,进样量太大,色谱柱与仪器的联接,除,HP,外，不同公司产品，其接头不同。处理不当时，会造成：,色谱峰展宽（死体积）使柱效下降、或渗漏,解决办法：,自制相应的转换接头,使用,“,通用,”,型接头（锥箍及螺母）,这种锥箍在不锈钢管上是活动的，因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从,Phase Separations,公司能得到一些,PEEK,工程塑料的接头，可用在所有类型的色谱柱上的。,Waters,色谱柱的联接,Waters,及,Phase Separations,锥箍及螺母相同，但锥箍前露出不锈钢管长度不同，其长度被称为：,“,stop-depth,”,Waters,除,Spherisorb,以外的各种品牌的色谱柱用的是,“,Waters,”,标准，其,stop-depth,的长度为,0.130,英寸,Spherisorb,品牌的色谱柱及,Phase Separations,公司其他品牌色谱柱用的是,“,Parker-style,”,标准，其,stop-depth,为0.090,英寸,不同的,Stop-Depth,长度,色谱柱以外的因素（二）,柱压过高问题，不一定是色谱柱问题！,系统反压问题,阻尼器堵塞,进样器堵塞,管路或连接口堵塞,在线过滤器不干净,保护柱,压力传感器不准确,流速是否错误,?,色谱柱以外的因素（三）,实验的重复性差,梯度实验时平衡时间不足,温度波动,流动相组成改变,样品溶剂不同,样品稳定性不好,方法的开发不好,缓冲液的,pH,值不合适,缓冲液的缓冲能力不足,流动相及样品的预处理,液相色谱实用技术（二）,液相色谱对流动相的要求,除色谱柱对流动相对的要求外，还有,与检测器匹配,脱气,避免卤素离子（不锈钢系统）,溶剂的粘度,细菌的生长,流动相的脱气,流动相脱气的目的,使色谱泵的输液准确,输液均匀准确，并且脉动减小,保留时间及色谱峰面积的重现性提高,提高检测的性能,防止气泡引起的尖峰,基线稳定，信噪比增加,溶剂的紫外吸收本底降低,保护色谱柱,减少死体积,防止填料的氧化,流动相脱气的方法,加热,简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化,抽真空,同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果,超声波,简单，但效果不理想。,通惰性气体（一般用氦气）,可保持连续脱气，多用于低压梯度,脱气机,可保持连续脱气，多用于低压梯度,样品的预处理,样品预处理的目的,除去微粒,减少干扰杂质,浓缩微量的组份,提高检测的灵敏度及选择性,改善分离的效果,有利于色谱柱及仪器的保护,样品的预处理重要性,占样品分析时间的比例,样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间,占分析的消耗总成本最大,消耗大量的溶剂及其他化学品,实验的重复性及准确性最差的环节,影响实验结果好坏的最重要因素,是决定性的步骤,样品预处理常用的方法,高速离心,过滤、超滤,选择性沉淀,衍生反应,液,-,固萃取,/液-,液萃取,Sep-Pak,样品处理小柱,其他,样品预处理的过程,去除微粒,过滤,过滤膜,/,过滤装置,有机,(0.5,m)/,无机,(0.45,m),膜片可更换,一次性使用的膜,“,Cartridge,”,使用方便简单，交叉污染小,有更小内径，可用于微量样品的处理,高速离心,大于：,10,000,g,选择性沉淀,常用于生化样品中除蛋白,有机溶剂,乙腈，甲醇,强酸,三氯乙酸，高氯酸,盐,50%,硫酸铵,10%,TCA,样品衍生,提高检测的灵敏度,增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度,增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器,改变分离的选择性,改变组份的基团，如：,变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离,典型的例子,氨基酸分析,样品衍生氨基酸分析,浓缩样品,浓缩样品的方法,萃取,/,吹干,沉淀,/,再溶解,色谱法,液固抽提,/,Sep-Pak,小柱,固相萃取（,SPE）,技术,固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份,固相萃取技术（,SPE）,的重要性,实验室中,6080%,的成本及工作量在样品制备上,加速样品的制备时间,降低样品前处理的成本,提高分析的准确性及回收率,更容易自动化,减少样品处理步骤,降低对不稳定样品的影响,提高安全性,Waters,的,Sep-Pak,小柱,Waters,专门开发了固相萃取技术,（,SPE）,Sep-Pak,小柱的应用领域,除去杂质及干扰组份,把样品分成不同极性的组分析,富集微量的组份,Sep-Pak,小柱的主要种类,反相,正相,离子交换,Sep-Pak,的种类,根据,Sep-Pak,及样品的性质，选洗脱强度不同的溶剂把样品分开,让样品的各组份在固定相上吸附、解吸附，或不与固定相作用,让所感兴趣的样品通过小柱，杂质留在柱上,让杂质留在柱上，所感兴趣的样品通过小柱,Sep-Pak,小柱的方法开发,SPE,方法开发的几个关键因素,文献查阅,Waters,有专门,Sep-Pak,应用资料的数据库（,P/N=88286）,查阅,Waters,的网页（,）,流速控制,同色谱理论：以,10,ml/min,润湿小柱，,15,ml/min,加载样品,离子交换填料或固定相少于,100,mg,的小柱，用更低的流速加载样品,以,15,ml/min,流速洗脱样品,注意样品本底的不同,注意载荷量及加样方式,用,Sep-Pak C,18,除去杂质,使极性的杂质先流出,中等极性样品流出，保留并分析,小柱及其非极性杂质丢弃,举例：多肽混合物脱盐,小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。,把样品载入小柱,盐等极性物先流出。,用更强,(,极性更弱,),的流动相洗出极性较弱的多肽,用,Sep-Pak C,18,富集,在分析前浓缩产物到,ppm,或,ppb,级,步骤,小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。,把大量,(,几百毫升,),样品载入小柱,溶剂流出,被分析的组份仍保留在柱子内,最后用少量,(,几毫升,),非极性溶剂洗出极性较弱的要分析的组份,谢谢！,