F04核酸化学s.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,核酸,-,遗传信息载体,-,元素组成特点,-,含磷高,(10%),-,基本分类：,DNA,-,主要遗传物质,RNA,-,参与遗传信息,的表达及调控,1.,概述,introduction,Base+Ribose+P,i,F.Miescher,1844-1895,1,10-12ab,肺炎球菌转化实验,Oswald Avery,et al,.(1944),DNA,分子中储存有遗传信息,注射活有毒菌 致死,注射活无毒菌 存活,-,有荚膜的,光滑型,有毒菌,-,无荚膜的,粗糙型,无毒菌,转化作用,从一个供体得到,DNA,、通过特定途径转授给另一受体并使后者的遗传特性发生相应的改变,1877-1955,2,10-12ce,注射灭活的有毒菌 存活,活无毒菌,注射 致死,灭活的有毒菌,活无毒菌,注射 致死,灭活有毒菌的,DNA,3,6,10-1,-,两类碱基均不饱和,-,环呈平面状,-,max,=260 nm,嘧啶,嘌呤,nucleotide,conjugated,double bond,without it in pyridine,imidazole ring,核苷酸,是核酸的构件分子,7,10-2,核苷酸含有两类,碱基,鸟嘌呤,腺嘌呤,胞嘧啶,尿嘧啶,胸腺嘧啶,F,取代为,5-FU,S,取代为,6-,巯基嘌呤,8,G11.10/12,编号区分,-,N,9,-,糖苷键,-,N,1,-,糖苷键,顺式构象时呈空间位阻,nucleoside,核苷,是,(,脱氧,),核糖的,N-(,糖,),苷,rapidly,(,cf,.p159),9,核苷酸,是核苷的,磷酸酯,AMP,10-6,2-AMP,3-AMP,2,3-cAMP,nucleotide,一定条件下,亦可形成,兼性离子,(,cf,.p164),10,G11.15,N,MP,磷酸化依次形成,N,DP,和,N,TP,水解时可释出更多能量,11,G11.17,pApCpGpU,(ACGU),pdTpdGpdCpdA,(TGCA),5,3,5,3,5,3,(,与阳离子以及,DNA,结合蛋白的,相互作用有助于,骨架结构的稳定,),交替的戊糖和,带负电荷,的磷酸,基团形成共价骨架,碱基序列,=(,脱氧,),核酸一级结构,(53),2.,核酸的结构,核酸一级结构,-,碱基均以反式,构象为主,-DNA,对碱水解,具有一定抗性,12,snake venom,3,5-,磷酸二酯键,bovine spleen,3,5,W34-10,(,脱氧,),核苷酸通过,3,5-,磷酸二酯键,连接成,(,脱氧,),核酸,free dNTP,deoxy-,PP,i,核酸聚合酶,DNA/RNA chain,(back to 10-36a),used for,next attack,13,Erwin Chargaff,1905-2002,DNA,的碱基组成是有规律的,-,具有种属特异性,-,同一个体没有组织,/,器官特异性,-,不会随个体的年龄、营养状况或,环境变化等而改变,Chargaff rules,(,cf,.p168),-,腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等：,A=T,-,鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数相等：,G=C,-,嘌呤残基总量与嘧啶残基的相等：,A+G=T+C,这一,DNA,碱基组成的定量关系暗示着,A,与,T,和,G,与,C,之间相互配对的,可能性,核酸的高级结构,14,DNA,纤维晶体的,X,射线衍射图,Rosalind Franklin&,Maurice Wilkins(1952),10-14,DNA,的二级结构为,双螺旋,double helix,螺旋结构,碱基堆积,(1920-1958),(1916-2004),3.4,间隔,15,10-15,DNA,的二级结构,双螺旋模型,James Watson&Francis Crick(1953),大沟,小沟,=10.5,个,碱基对,original model,16,G12.9,扭 曲,-,糖环平面几乎与碱基平面成直角,-,碱基平面与螺旋长轴垂直,-,双,螺旋结构稳定的,主要维系力,a),双链互补碱基对之间的氢键,b),碱基堆积力,=,疏水互作,+,范德华力,(BSF:base stacking force),c),链骨架上负电性磷酸基团提供的盐键,17,Key concepts,for DNA double helix model,-,两条反向,(5,3,),平行的多核苷酸链围绕同一中心轴,缠绕形成,右手双螺旋,-,两条链上的碱基通过氢键相互连接形成碱基,(,互补,),对，,GC,A=T,，,碱基均呈,反式构象,-,交替的脱氧核糖与带负电荷的磷酸骨架位于双螺旋的,外侧，糖环平面几乎与碱基平面成直角,-,碱基堆积在双螺旋内部，碱基平面与螺旋长轴垂直，,依靠其疏水性和近似平面的环结构而紧密叠加在一起,-,双螺旋平均直径为,2nm(,实测,2.37),，相邻碱基对距离为,0.34nm(0.33),，相邻核苷酸夹角为,36(34.6),，沿螺,旋长轴每转含,10,个,(10.4),碱基对，螺距为,3.4nm(3.6),-,碱基对的堆积和糖,-,磷酸骨架的扭转导致螺旋表面形成,两条不等宽的沟,(=,调控分子作用处,),18,10-11,A,T,G,C,H bonding patterns in base pairs,defined by Watson&Crick,W-C bps most stable,19,DNA,双螺旋具有不同构象,10-19,A B Z,外形 粗短 适中 细长,螺旋方向 右手 右手,左手,螺旋直径,(nm)2.55 2.37 1.84,碱基轴升,(nm)0.23 0.34 0.38,碱基夹角,()32.7 34.6 60*,碱基数,/,圈,11 10.4 12,-W-C,模型依据的是,B,型,-,自然态,DNA,多为,类,B,型,间插有短序列,A,型,-,自然存在的,Z,型,很少,20,24-9/11/12,自动形成的额外超螺旋可以,抵消,过旋或欠旋,造成的应力,(,环状,),双螺旋可以形成,超螺旋,结构,relaxed,increased supercoiling,bacterial,plasmid,DNAs,supercoil,21,24-30,packing ratio,1.210,4,680,40,67,1,2 nm,11 nm,150 nm,300 nm,700 nm,1,400 nm,真核生物染色体,组装层次结构,人体最大的染色体有,2.4*10,8,碱基对，以松弛,B,构象展开可达,8.2cm,，但在细胞分裂中期最大压缩态时仅,10,m,22,tRNA,二级与三级结构,三叶草结构模型,(1965),二氢尿嘧啶,假尿嘧啶,Robert W.,Holley,1922-1993,1968 NP,in Phys/Med,23,10-29,3.,核酸性质与研究技术,核酸双链在体外可以变性和复性,fast,slow,zippering,变 性,DNA,双链受,变性因素,影响而使氢键、碱基堆积力及疏水键等破坏、双螺旋结构解体成单链,(,共价键不断裂,),24,H19.16,核酸变性的增色效应,-,在,pH 7,时，变性,DNA,的紫外吸收值比双股,DNA,的高,1240%,-,等量,游离,脱氧核苷酸,的紫外吸收值比单链,DNA,的更强,hyperchromic effect,less base stacking,UV abs.for proteins,usu.at 280 nm,(used to check for,if contaminated),(=,碱基暴露,紫外吸收,),25,H19.17,T,m,与溶液,离子强度,/pH,密切相关,DNA,的融解曲线,Poly(GC),样品,UV,吸收值的增加等于,DNA,完全变性,/,解链时的,一半,-,盐,可屏蔽磷酸骨架的负电荷,而有利于双链稳定及复性,-pH,可通过影响碱基解离,而干扰配对氢键的稳定,8295,0.14,摩尔法,分离提纯,DNP/RNPDNA/RNA,26,10-32,核酸分子,杂交,(hybridization),=,不同来源的核酸可以形成杂化体,两种,DNA,的序列越相似，形成的杂化体越多,-Southern Blotting,用,探针,检验,DNA,-Northern Blotting,用探针检验,RNA,已知序列并用,32,P,标记的,DNA/RNA,分子,/,片段,27,principle of Southern blotting,将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程,-,硝酸纤维素膜能同,单股,DNA/RNA,强力结合,28,palindrome,(b),H19.30,-,两类限制性内切酶,型,既可催化宿主,DNA,的甲基化、又可切割没有甲基化的,(,外源,)DNA,型,只具有核酸酶活性，另有单独起甲基化作用的,限制性甲基化酶,与之配套，催化在同一识别序列处碱基的甲基化,识别序列及方向,限制性内切酶是一类重要的,DNA,内切酶,A,残基在识别位点甲基化,未甲基化的,DNA,断裂成,黏性末端,甲基化酶的,高亲和性底物,自体,外源,(,eg,.virus),29,10-36a,DNA,合成酶作用需要,-,模板,-,引物,-,dNTP,生成磷酸二酯键,(,cf,.W34-10),DNA,序列可通过,双脱氧链终止法,测定,30,10-36c,双脱氧链终止法,测定,DNA,序列,(Frederick Sanger,1977),NP in Chemistry 1980,缺乏继续反应生成磷酸二酯键的能力,前提,电泳技术已发展至能够区分出仅具有,单个核苷酸差异,的,DNA,片段,使同一套,片段的末,端均固定,为同一种,核苷酸,31,-,需要有限制性内切酶在特定位点切割,DNA,-,分离出的,DNA,片段能与作为载体的外源,DNA,连接,-,有能力鉴别出含有重组,DNA,的载体克隆,制备外源,DNA,在特定位点切割,DNA,和,载体,将外源,DNA,片段与载体连接,利用载体将重组,DNA,导入宿主细胞,(,转化,),重组,DNA,在宿主菌内大量复制,筛选和鉴别含有重组,DNA,的宿主细胞,Paul Berg,于,1972,年将外源,DNA,片段插入猴病毒,SV40,环状,DNA,分子内而首次获得,DNA,体外重组,基本前提,一般步骤,常用,E.coli,的质粒，并以某种抗生素抗性基因标记,(,例如氨苄青霉素抗性基因,),利用特殊修饰酶可以制作重组,DNA,32,H23.1,制作重组,DNA,基本步骤,key concept,用,同一种,限制性内切酶切割外源,DNA,和质粒载体,NP in Chemistry 1980,for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids,with particular regard to recombinant-DNA,Paul Berg,1926-,33,Kary B.Mullis,1944,-,NP in Chemistry 1993,for his invention(1985)of the polymerase chain reaction(PCR)method,每一轮循环经过变性、退火和延伸，,DNA,含量即增加一倍，通常扩增倍数可达,10,6,DNA,聚合酶链反应,PCR,-,热变性,95,4560s,(,起始,510 min),-,退火,55,1 min,-,延伸,72,1 min,(,最后,10 min),2530 cycles,getting,enough,target,for DNA,analysis,34,作 业,复习题,(p8595),一、选择,1315,1719,29,3437,二、填空,16,1012,17,19,20,2428,31,32,四、判断,1,2,10,11,13,15,24,30,31,3941,五、问答,1,3,23,27,1.,简述核酸变,-,复性过程及其特点,2.DNA,测序常用的双脱氧链终止,法依据的原理是什么,？,3.,试比较,DNA,和,RNA,一级结构,的异同点,35,