zj基因工程第4章(基因扩增).ppt

基因扩增的主要方式：,PCR技术,体外DNA重组,环境协迫,程序基因扩增,生物进化的结果,一.PCR基本技术原理,二.PCR体系,三.PCR引物设计原则,四.PCR技术的类型及其在基因克隆方面的 应用,生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,1971年，,Khorana,提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。,1.1,PCR技术简史,构思到实现,1985年，美国PE-Cetus公司的,Mullis,等人发明了聚合酶链反应（PCR），并因此于1993年获诺贝尔化学奖。,Har Gobind Khorana,Kary.B.Mullis,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,子链延伸,DNA加倍,DNA变性,形成2条单链,模板DNA,95,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,55,引物1,引物2,DNA引物,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,引物1,引物2,DNA引物,72,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,第1轮结束,95,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,55,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,94,37,55,DNA,聚合酶,高温解链,低温退火,适温延伸,94,72,55,Taq,聚合酶,高温解链,低温退火,适温延伸,PCR循环,PCR循环,85年使用,E.coli,DNA聚合酶时,88年使用,Taq,DNA聚合酶后,Taq,DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度,(),40 50 60 70 80 90,100,80,60,40,20,PCR自动热循环仪,1.2 PCR的基本原理,标准的PCR反应体系,4种dNTP混合物 各200umol/L,引物 各10100pmol,模板DNA 0.12ug,Taq DNA聚合酶 2.5u,Mg,2+,1.5mmol/L,标准的PCR反应条件,1,95,30s-60s,2,55,30s-60s,3,75,30s-60s,Go to 1 Rep 24,1.2 PCR的基本原理,高温模板DNA解链,低温引物与模板DNA退火,适温引物引导子链延伸,所需的特异性短产物片段是由引物所界定的,1.3 PCR技术的特点,特异性,灵敏度高,简便、快速,对样品的纯度要求低,本节重点：,PCR,技术的基本原理,课后思考题：,1、PCR技术的灵敏性提示我们在进行PCR操作中需要注意什么？2、在模板DNA上若有多个引物结合位点会出现什么情况？,2.1 PCR反应成分,引物,Taq DNA聚合酶,模板,dNTP,Mg,2+,浓度,其它,第二节 PCR反应体系,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列,启动子序列,定点突变,探针标记,2.1.1 引物,引物是PCR,特异性反应,的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度,理论上，只要知道任何一段模板序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增,引物,引物浓度,0.1-0.5 mol/L,浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,2.1.2 Taq,DNA聚合酶（thermus aquaticus),Taq,DNA聚合酶的功能,0.5-2.5 U/50,l,酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,Taq,DNA聚合酶,的种类,2.1.3 dNTP,dNTP浓度取决于扩增片段的长度,四种dNTP浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,dNTP可与Mg,2+,结合，使游离的Mg,2+,浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,2.1.4 Mg,2+,Mg,2+,是DNA聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg,2+,浓度。,2.1.5 模板,单、双链DNA均可。,不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。,一般100ng DNA模板/100,L。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,变性,使双链,DNA,解链为单链,95,o,C 20-30,秒,(2),退火,温度由引物长度和,GC,含量决定。,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合,;,降低温度可增加反应的灵敏性。,2.2 循环参数,（3）延伸,70-75,o,C，,延伸时间由扩增片段长度决定,（4）循环次数,主要取决于模版DNA的浓度,一般为25-35次,次数过多：扩增效率降低,错误掺入率增加,引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。,现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。,第三节 PCR引物设计,3.1 引物设计一般原则,：,（,1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。,（2）引物长度以15-40 bp为宜。,（3）,碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。,（4）引物内部避免形成二级结构。,（5）两引物间避免有互补序列。,（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,引物设计,需要考虑的因素,引物长度（,primer length,）,产物长度（,product length,）,序列,Tm,值,(melting temperature),引物与模板形成双链的内部稳定性,(internalstability,用,G,值反映,),引物二聚体及发夹结构（,duplex formation and hairpin,）,错误引发位点（,false priming site,）,引物及产物,GC,含量（,composition,）,有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。,一般,引物的长度,为,15-30bp,，,常用的长度为,18-27bp,，但不应大于,38,。因为过长会导致其延伸温度大于,74,，即,Taq,酶的最适温度,较长的引物（28-35bp),一般是用来,区分同源性较高的模板序列,或者,用于产生一些突变位点,引物设计,要点,（,1,）,PCR产物长度 500bp 引物长度 16 18 bp,PCR产物长度 5kb 引物长度 25bp,引物设计,要点,（,2,）,引物,3,端的碱基一般不用,A,，,因为,A,在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。,3,端防止连续三个,C,或,G,引物的,GC,含量一般为,45-55%,，过高或过低都不利于引发反应。,上下游引物的,GC,含量不能相差太大。,引物设计,要点,（,3,）,引物所对应模板序列的,Tm,值最好在,72,左右,，当然由于模板序列本身的组成决定其,Tm,值可能偏低或偏高，可根据,具体情况灵活运用,。,(3)邻近分析法(thenearest neighbormethod),:,从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。,引物设计,要点,（,4,）,G,值反映了引物与模板结合的强弱程度,.,一般情况下，引物的,G,值最好呈正弦曲线形状，即,5,端和中间,G,值较高，,(,有利于引物与模板序列的整合,);3,端,G,值相对较低,(,3,端,G,值影响,DNA,聚合酶对模板,DNA,的解链,过高则不利于这一步骤,),。,可防止错误引发。,引物设计,要点,（5）,可能的,错误引发位点,决定于引物序列组成与模板序列组成的,相似性,，相似性高则错误引发率高，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。,错配（或称假引发）将导致产生,非专一 产物,引物二聚体及发夹结构,的能量一般不要超过,4.5,，否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓度从而导致,PCR,正常反应不能进行。,引物设计,要点,（6）,1、发夹结构（Hairpin）自身互补,2、二聚体（Dimer）两个引物间互补,对引物的修饰一般是在,5,端增加酶切位点,，应参考载体的限制酶识别序列确定，以有利于以后的工作。,引物设计,要点,（7）,3.2 引物设计软件,常用的引物设计软件,Primer Premier 5,Oligo 5/6,碱基频率窗口,碱基退火温度窗口,序列内部碱基稳定性窗口,Oligo 6.22,Primer Premier 5,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq,Choose a function,简并引物,有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸的遗传密码不只一种，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为,简并引物。,嵌套引物,第四节、PCR的类型和应用,研究,基因克隆，,DNA,测序，分析突变,诊断,细菌、病毒、寄生虫检测，诊断,人类基因组工程,遗传图谱的构建，,DNA,测序，表达图谱,法医,犯罪现场标本分析,肿瘤,各种肿瘤检测,其他,4.1 已知DNA序列的PCR技术,4.1.1 不对称PCR,目的：扩增产生特异长度的单链DNA。,方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。,用途：制备核酸序列测定的模板,制备杂交探针,基因组DNA结构功能的研究,高浓度引物,低浓度引物,4.1.2 巢式PCR,目的：增加扩增的灵敏度和检测的可靠性。,方法：通过两对引物来进行,是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。,巢式PCR,原理图,4.1.2 等位特异PCR,目的：检测突变位点。,方法：引物3端设计有突变位点，利用Taq酶的3-5外切酶的校正功能来使有突变的模板与常规引物之间扩增受阻来进行检测。,4.1.3 竞争引物PCR,目的：检测突变位点。,方法：引物中设计有突变位点，利用引物与模板匹配的程度来使突变引物和正常引物进行竞争来检测突变样品。,COP,-PCR,1 2 3 4 5 6 7 8,PCR,1 2 3 4 5 6 7 8,引物特异性,4.1.4 单链构象多态PCR,目的：检测突变位点。,方法：通过单链DNA具有一定的构象，从而在PAGE凝胶电泳中的泳动行为不同而检测突变位点。,4.1.5 降落PCR,目的：优化PCR的一种策略。,方法：逐渐降低退火温度。,4.1.6,多重PCR,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,4.1.7,LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直观地检测目的基因。,特别适合大量临床标本的基因诊断,可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,PCR,观察,PCR产物,4.1.8,PCR固相分析法,模板,生物素化引物,PCR扩增,探针,亲和固相介质,检测探针信号,4.1.9,原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。,直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增。可进行细胞内定位。,适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,原位PCR的作用,既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。,ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,操作步骤,细胞或组织的固定,PCR扩增细胞内目的片段,原位杂交检测扩增产物,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,4.2 逆转录PCR（RT-PCR）,逆转录酶,DNA聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,基因,mRNA,蛋白质多肽链,4.3.1 锚式PCR,已知靶基因片段一端的序列,4.3,已知cDNA一端序列获得全长cDNA的PCR,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,已知一端序列引物,3-FULL RACE原理,5-FULL RACE扩增原理,4.4.1 反向PCR(reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,4.4,已知侧翼序列的PCR,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,4.4.2 锅柄PCR(panhandle PCR),已知序列,未知序列,4.4,已知侧翼序列的PCR,5,3,3,5,已知序列,未知序列,5,3,单链引物,5,3,1 3 2 4,4 2 3 1,4 2 3 1,1 3 2 4,4 2 3 1,引物1,引物2,4.5.1 岛屿获救PCR(island rescue PCR),是利用真核基因5端存在的CpG岛及基因内部每3Kb即出现的Alu重复序列作为随机引物来进行扩增未知序列的DNA。,未知序列,4.5,未知序列的PCR,稀有酶切位点,CpG岛,Alu重复序列,酶切,加泡状接头,泡状引物,Alu引物,实时PCR技术原理,4.5,实时定量PCR,什么是,实时荧光定量,PCR,所谓实时荧光定量,PCR,技术，是指在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,4.5,实时定量PCR,三步循环：高温变性，低温退火，中温延伸,94 3min,94 10sec,60 15sec,72 20sec,Go to 2 for 29 cycles more,72 7min,4 forever,指数扩增,实时荧光定量,PCR,原理,之,PCR原理,指数期,平台期,S1 S2 M,DNA Engine,常规PCR：,PCR后借助电泳对扩增反应的,终产物,进行,定量,及,定性,分析,实时荧光定量,PCR,原理,之,定量原理,反应体系中加入荧光物质,荧光检测单元：检测,荧光信号,的强度,荧光强度代表,PCR,扩增产物的量,每个循环检测荧光强度 连接生成,实时扩增曲线,对,起始模板,的,定量分析,Opticon,荧光检测单元,实时荧光定量,PCR,原理,之,定量原理,引入两个概念：,阈值,（,Threshold,）：,在荧光扩增曲线指数增长期设定一个,荧光强度,标准,(,即,PCR,扩增产物量的标准,),Ct,值：,PCR,扩增过程中，扩增产物量,(,荧光强度）到达阈值时所经过的,循环次数,Threshold line,C(t)value,C(t)value,18.12+/,-,0.04,域值线,C(t)值,-,-,指数期,平台期,实时荧光定量,PCR,原理,之,定量原理,初始模板,浓度,越高，产生相同量产物（,阈值,）所需,循环数,（Ct值）,越少。,实时荧光定量,PCR,原理,之,定量原理,如何对,起始模板,定量？利用,指数扩增,原理,PCR,指数,扩增期：,理想的,PCR,反应：,X=X,0,2,n,实际的,PCR,反应,X=X,0,(1+,Ex,),n,n：扩增反应的循环次数,X：第n次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,Ex：扩增效率,实时荧光定量,PCR,原理,之,定量原理,在扩增产物达到阈值线时,:,X,Ct,=X,0,(1+Ex),Ct,=,N,(1),X,Ct,:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.,在阈值线设定以后为常数,设为,N,.,方程式(1)两边同时取对数:,lg N=lg X,0,(1+Ex),Ct,(2),整理方程式(2)得:,lg,X,0,=-lg(1+Ex)*,Ct,+lg N (3),初始模板量的对数,与,Ct值,呈 线性关系,实时荧光定量,PCR,原理,之,定量原理,初始模板的绝对定量,检测灵敏度高,可以检测到低拷贝的目的基因,可以检测到单拷贝模板,可以区分微小的拷贝数差异,128,256,512,1024,个拷贝,线性范围广：,8,10,个数量级,可对初始模板含量差异较大的样品同时定量，无需浓缩或稀释,省时省力,实时荧光定量,PCR,原理,之,优势,荧光染料,SYBR Green I,荧光探针,Molecular Beacon,TaqMan,R,Q,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,SYBR Green I,与,双链,DNA,具有高亲和力,与,双链,DNA,结合后，荧光增强约,1000,倍。,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,G,T,T,T,T,T,T,G,G,G,G,C,C,C,C,C,C,C,C,A,A,A,A,A,T,A,C,C,G,G,G,G,T,T,A,C,G,A,A,C,G,G,T,A,A,T,变性,DNA,游离,SYBR Green 1,变性阶段,:双链DNA解开，SYBR green I游离,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,G,T,T,T,G,G,C,C,C,C,C,C,C,A,A,A,G,G,G,A,C,T,T,G,A,T,A,G,C,A,T,C,G,T,A,A,游离,SYBR Green I,延伸阶段：,SYBR green I与生成的双链DNA产物结合，激发,产生荧光信号，进行检测,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,94 3min,94 10sec,60 15sec,72 20sec,Plate read,Go to 2 for 39 cycles more,72 7min,4 forever,Plate read：,每个循环,延伸,结束后读取荧光信号,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,优点,使用方便,-,不必设计复杂的,荧光探针,通用性强,-,与所有的双链,DNA,结合，,可用于不同的模板,便宜,缺点,与非特异性产物结合,SYBR Green I,优缺点,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,探针,报告基团,淬灭基团,水解,型杂交探针,TaqMan探针,5,3,荧光素,淬灭剂,与目标序列互补,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,退火阶段,:,模板和探针杂交,3,3,5,5,TaqMan工作原理,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,延伸阶段,:开始聚合反应,5,5,3,3,TaqMan工作原理,Taq酶,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,TaqMan工作原理,Forward,Primer,Reverse,Primer,Q,R,3,3,5,5,延伸阶段,:Taq酶切下探针5端荧光素，激发产生荧光,Taq酶,每产生一条,DNA,链，就切断一条探针,每切断一条探针，就产生一个单位信号,信号强度与,结合探针的,DNA,分子数,成正比,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,对目标序列有很高的特异性,-特别适合于SNP检测,与 Molecular Beacons,相比设计相,对简单,价格较高,只适合于一个特定的目标,不能进行融解曲线分析,TaqMan优点与缺点,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,优点,：,缺点：,Molecular Beacons,发夹,型杂交探针,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,Molecular Beacons,原理：,荧光谐振能量传递,（FRET）,茎由互补配对的序列组成,环与目标序列完全配对,茎,荧光素,淬灭剂,环,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,变性阶段,:,探针游离,Molecular Beacons工作原理,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,T,A,C,C,G,G,G,G,G,T,T,A,C,G,A,A,C,G,G,T,A,A,T,T,T,T,T,G,C,C,C,C,C,A,A,A,A,Q,荧光素,目标序列,茎,淬灭剂,退火阶段,:,探针与目的片段结合,报告基团与淬灭基团分离,激发产生特异性荧光,Molecular Beacons工作原理,环形结构与目的片断的结合比茎部的配对更稳定,游离探针,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,延伸阶段,:,探针与目的片段分离，重新形成茎环结构,Molecular Beacons工作原理,游离探针,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,对目标序列有很高的特异性,SNP检测最灵敏试剂之一,荧光背景低,设计困难,只能用于一个特定的目标,无终点分析功能,价格较高,Molecular Beacons,优点与缺点,实时荧光定量,PCR,原理,之,荧光检测原理,优点：,缺点：,Chromo4,Opticon I/II,突破性光路设计,先进的温度控制能力,性能卓越,Bio-rad 实时定量系统系列,My iQ,iQ5,MiniOpticon,5色检测,48孔，小巧精致,Bio-rad 实时定量系统系列,5.PCR技术的应用,核酸的基础研究,序列分析,检测基因的表达,从cDNA库中放大特定序列,研究已知基因片段邻近基因或未知DNA片段,进化分析,医学应用,分子生物学证据,性别鉴定,转基因检测,PCR技术的应用,1)基因克隆,重组DNA,质粒DNA,基因片段,5,5,Bam H I,Bam H I,Bam H I,Bam H I,GTCC,GGAC,CCTG,CAGG,GTCC,GGAC,CCTG,CAGG,CCTG,GGAC,GTCC,CAGG,质粒DNA,目的基因,限制性核酸内切酶,2)基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,病原微生物基因,正常人 (-),病 人 (+),A,正常人,病 人,正常,病人,PCR-RFLP法：,限制性内切酶,3）基因多态性检测,正常Ras基因,突变,限制性内切酶,异常Ras基因,正常,突变,电泳,本章重点内容,概念：,简并引物；RT-PCR；反向PCR；实时荧光定量PCR;,问答：,PCR技术的基本原理；,引物设计应遵循的原则；,如何利用3-Full RACE 和 5-Full RACE克隆全基因？,实时荧光定量PCR定量原理？,