固定化酶.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,直接应用酶的不足之处:,(1)酶的稳定性差,在温度、pH和无机离子等外界因素的影响下,容易变性失活,(2)酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产,(3)酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难,固定化的思路,：,将酶束缚于特殊的相，使之与整体相（或整体流体）分隔开，但仍能进行底物的效应物（激活剂或抑制剂）的分子交换。,固定化的目的,：,使固定化酶既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，生产工艺可以连续化、自动化。,固定化的对象,：,酶、细胞、细胞器,一、固定化酶的定义,固定化酶,是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可以重复使用。,概念发展,“水不溶酶”（water insoluble enzyme),“固相酶”（solid phase enzyme),1971年第一届国际酶工程会议正式采用“,固定化酶（immobilized enzyme),”,固定化酶的制备原则：,必须注意维持酶的催化活性及专一性,固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产量,固定化应有利于生产自动化、连续化,酶与载体应结合牢固，从而使酶能回收贮藏，利于反复使用,固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应,固定化酶成本要低，以利于工业使用,包埋法,结晶法,分散法,物理吸附法,离子结合法,交联法,共价结合法,微囊法,网格法,非共价结合法,化学结合法,二、酶的固定化方法,1、非共价结合法,(1)结晶法,使酶结晶从而实现固定化的方法。对于晶体法来说，载体就是酶蛋白本身，它提供了非常高的酶浓度。对于活力较低的酶来说，这一点就更具优越性。,在重复循环中，酶会有损耗,(2)分散法,将酶分散于水不溶的有机相中从而实现固定化的方法。可以通过过滤和离心的方法将酶进行分离和再利用。,在有机溶剂中，酶的构象和稳定性影响其活力。,(3)物理吸附法,酶被吸附于不溶性载体的一种固定化方法。载体包括无机载体、天然高分子载体和大孔型合成树脂、陶瓷等。,物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，因而酶活力损失很少。但是它有酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等缺点。,(4)离子结合法,是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。常用载体有DEAE-纤维素，DEAE-葡萄糖凝胶；CM-纤维素等。,此法操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。但是固定化的酶容易受缓冲液影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。,2、化学结合法,(1)共价结合法,酶与载体以共价键结合的固定化方法。,酶分子中可以形成共价键的基团主要有：,-氨基或,-氨基，,、,或,位的羟基、巯基、咪唑基、酚基等。,所用载体主要有：天然有机载体、无机载体和合成聚合物等。,用,共价结合法,制备的固定化酶，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落，可以连续使用很长时间。但载体活化的操作复杂，而且由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心，因此往往不能得到比活力高的固定化酶，酶活回收率一般为30左右，甚至会影响对底物的专一性，或影响酶的空间构象而影响酶的催化活性，使酶的性质发生变化。,羟基聚合物载体：溴化氰法,多胺载体：重氮法,(2)交联法,就是用双功能或多功能试剂与酶或微生物细胞之间交联的固定化方法。,参与交联反应的酶蛋白的功能团有,N末端的,-氨基、赖氨酸的,-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基,等。,作为交联剂有形成希夫碱的,戊二醛,，形成肽键的,异氰酸酯,，发生重氮偶合反应的,双重氮联苯胺,或,N,N-乙烯双马来亚胺,等。,戊二醛交联法,包埋法可分为,网格型,和,微囊型,两种，将酶包埋于高分子,凝胶细微网格,中的称为网格型，将酶包埋于,高分子半透膜,中的称为微囊型。,包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，对于作用于大分子底物和产物的酶是不适合的。,3、包埋法,(1)网格型,载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物以及淀粉、胶原、明胶、海藻酸和角叉莱胶等天然高分子化合物。网格型包埋法也是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。,(2),微囊型,微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是酶对反应条件要求高的，制备成本也高。,特性,物理吸附法,离子结合法,包埋法,共价结合,交联法,制备,易,易,易,难,难,结合力,中,弱,强,强,强,酶活力,高,高,高,中,中,底物专一性,无变化,无变化,无变化,有变化,有变化,再生,可能,可能,不可能,不可能,不可能,固定化费用,低,低,中,中,高,固定化酶方法的优缺点比较,三、固定化酶的性质,固定化后酶活力的变化,固定化对酶稳定性的影响,固定化酶的最适温度和,最适,pH,变化,固定化酶的米氏常数变化,1、固定化后酶活力的变化,固定化酶的活力大多比天然酶小，其专一性也能发生改变。,固定化胰蛋白酶对高分子底物只显示原酶活力的,30%,，而对低分子底物的活力保持,80%,。,固定化酶活力低于原酶的原因：,固定化过程影响活性中心的构象,固定化影响酶分子活性中心对底物分子的定位作用,内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻,酶被包埋时，半透膜影响大分子底物与酶的接近,2、固定化对酶稳定性的影响,大多数情况下，,酶经过固定化，其稳定性都有所增加,，包括热稳定性提高；对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高；对不同pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性提高。,原因：固定化防止了酶分子的伸展变形；固定化使酶活力缓慢释放；抑制酶的降解,固定化酶的热稳定性变化,1固定化酶；2天然酶,大多数酶在固定化后与溶液酶相比，有较高的热稳定性,，如氨基酰化酶。溶液酶在75保温15min，活力为0；DEAE-Sephadex固定化酶在同样条件下仍有80；DEAE-纤维素固定化酶在同样条件下还有60活力。其他如固定化乳酸脱氢酶、脲酶等都比溶液酶的热稳定性提高，这种性质对工业上的应用是有益的。固定化酶反应的温度一般较溶液酶的高，如用CM-纤维素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比溶液酶高5-15。但有时固定化酶的热稳定性和最适温度都低于溶液酶的。,溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力。,比如：氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20，而将其固定于DEAE-纤维素上在同样条件下仍有80的活力。这可能是因为蛋白酶分子量大，受到空间位阻，不能进入固定化酶中,酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力,。例如氨基酰化酶与固定于DEAE-Sephadex的氨基酰化酶比较，前者在6mol、2mol胍、1SDS和4mmol丙酮溶液中活力分别为9、49、1和55，而后者在相应溶液中活力则分别为146、117、35和138。,固定化酶在操作中可以长期使用,，半衰期(t,1/2,)，即酶活性达到原有酶活性一半时所需的时间较长,3、固定化酶的最适温度和最适pH的变化,由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高。,酶固定化后，对底物作用的最适,pH,和酶活力,-pH,曲线常发生偏移。原因是微环境表面电荷性质的影响。,带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适,pH,向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反。,尽管大多数固定化酶的活力,-pH,关系曲线仍为钟形曲线，但与溶液酶比较，其钟形更陡，或更坦，向酸性或碱性方向偏移。,天冬酰胺酶固定化前后的酶活力-pH曲线 1固定化酶；2游离酶,4、固定化酶的米氏常数变化,固定化酶的表观米氏常数随载体的带电性能变化,载体电中性时，表观K,m,上升,载体电荷与底物相反时，表观K,m,低于溶液酶K,m,载体电荷与底物相同时，表观K,m,显著增加,固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的性质,(1)酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化,(2)载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起的变化,总结影响固定化酶性能的因素,四、固定化酶的应用,药物控释载体,生物传感器,药物应用临床不顺利的原因:,蛋白类药物被胃酸破坏；被肝和血液中的酶系统清除；药物本身毒副作用；免疫问题；药物稳定性差,药物新剂型发展的核心特点：,从时间和空间的分布上控制药物的释放,1,、药物控释载体,聚合物修饰,用适当的水溶性高分子对药物加以修饰以改善其性能,。,药物的聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)修饰即PEG化,是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白质、多肽、小分子有机药物和脂质体上。,药物的聚乙二醇修饰技术能够延长药物的半衰期,增强药物的稳定性,降低免疫原性和抗原性;改变了药物的分子结构从而改进了药物动力学和药效学的性质,提高了作用部位的血药浓度。同时,比未修饰药物表现出更好的耐受性,增加了注射药物的临床应用范围和疗效,已成为药物化学修饰研究领域的热点。,凝胶包埋,用生物相容性好的高分子与药物混合制成含有药物的凝胶，植入体内特定部位，以达到缓释给药的效果。,响应性高分子凝胶,的自身可以感知外界环境的细微变化，并能产生相应的物理结构和化学性质的变化甚至突变。这种凝胶的突出特点是在响应过程中有显著的溶胀行为。,以智能高分子材料为基础，可以使药物释放系统智能化，当需要药物时则释放，否则不释放。这种体系的特点是药物的需要与否由药剂自身判断，集传感、处理、执行功能于一身，它可以感知疾病所引起的化学物质及物理量的变化信号，药剂根据对此信号的响应自反馈而释放药物或终止释放。,pH敏感给药体系,利用凝胶在不同pH值下溶胀度、渗透性能的不同，达到靶向给药、控制药物释放浓度的作用，特别适用于肠胃给药方式。Kono等人用部分交联的丙烯酸-乙烯亚胺共聚物构成直径为4.6mm的胶囊，胶囊含水量随pH值的变化而变化。当胶囊包载模式药分子对甲苯磺酸盐后，胶囊可根据环境的pH值对药分子的渗出进行控制，使药分子在中性pH值下渗透力低，在低pH值下渗透力高。,PH敏感凝胶对肿瘤细胞的靶向药物的研究及其重要。由于肿瘤细胞表面富集神经氨酸，且肿瘤细胞代谢作用旺盛，剧烈生成酸性化合物，所以肿瘤细胞的微环境比正常细胞酸性要强。Kitano等人利用这一特点，研究了用于肿瘤化疗的pH响应药物控释体系。,生化响应性给药系统,生化响应性给药系统多是为控制胰岛素药物的释放而设计的。生物体中的血糖值由肝脏控制，糖尿病患者血中的葡萄糖浓度过高，需要胰岛素药物促使组织吸收血中葡萄糖，使血中糖浓度降低。另一方面血中葡萄糖浓度过低时，会危及生命。所以为使胰岛素药量控制在适宜水平，人们设计了对葡萄糖响应的胰岛素给药系统。Makino等人制备了含刀豆球蛋白A(ConA)和有生理活性的糖基化胰岛素(G-胰岛素)的疏水性尼龙胶囊。在血糖浓度低时，胶囊中的G-胰岛素被束缚在ConA蛋白上，不能扩散到胶囊外的血液中；血糖浓度偏高时，葡萄糖扩散进入胶囊，与G-胰岛素竞争结合在ConA上，从而有一定量的胰岛素被替换下来进入血液发挥药效。血糖水平下降时，取代反应被抑制，G-胰岛素停止释放。,微球制剂,用高聚物微球包埋或化学偶联药物可制成微球制剂，它具有靶向性，缓释性及减少抗药性等特点。,微球制剂具有对组织的亲和性和对特殊部位的选择性，能使药物直接指向该部位（靶区），使靶区很快达到所需浓度，从而减少药物用量，相对减少了药物对正常机体组织的副作用，特别是降低了对肝、肾、脾等造血和排泄系统损害。因此，以微球制剂作为药物载体抗肿瘤方面的研究日益深入。,抗癌药制成微球制剂，可提高药物对肿瘤细胞的靶向性，使药物主要浓集在癌症部位长时间滞留缓慢释放，延长药效同时减少全身毒副作用；还可利用现代新技术如介入疗法，将药物微球栓塞在肿瘤动脉末梢血管处，一方面切断癌细胞的血液供应，另一方面可使药物缓慢释放，提高局部浓度，从而杀死癌细胞，以达到治疗目的。近5年来，我国进行了多个抗癌药物微球制剂，如阿霉素明胶胶微球、丝裂霉素明胶微球、顺铂聚乳酸微球、甲氧喋呤明胶微球、阿霉素聚乳酸微球等的研究，为治疗晚期癌症开创有效途径。,磁性药物微球,由磁性材料和具有一定通透性但又不溶于水的骨架材料所组成，用体外磁场将其固定于肿瘤部位，释放药物，杀伤肿瘤细胞。这样既可避免伤害正常细胞，又可减少用药剂量，减轻药物毒副作用，加速和提高治疗效果，显示特有的优越性。此制剂还可运载放射性物质进行局部照射，进行局部定位造影，还可以用它阻塞肿瘤血管，使其坏死。,脂 质 体,脂质体是磷脂双分子层在水溶液中自发形成的超微型中空小泡。,脂质体对机体毒副作用小，其脂质双分子层与生物膜有较大的相似性与组织相溶性，易于被组织吸收。脂质体包裹药物为物理过程，不改变药物分子结构，当药物被包裹后可降低药物毒性，减小药物使用量，具有缓释和控释作用。,抗癌药物脂质体,细胞毒性药物对机体正常组织和病理部位无选择性，在使用中具有一定困难，最好的方法是使药物直接达到病理部位。Eric等研究表明，脂质体包裹的阿霉素比游离药物的毒性要降低50%一70%，在抑癌活性上脂质体剂型比游离药物高许多，用阿霉素脂质体多次治疗可增加荷瘤动物的存活时间，而使用游离药物时动物存活时间并不延长。许多药物如放线菌素D、丝裂霉素、氨甲喋呤、博来霉素、顺铂等都已用脂质体包裹，美国FDA已批准了阿霉素脂质体TLCD99、两性霉素B、柔红霉素脂质体进入临床试验。,多肽及酶类药物脂质体,多肽、酶类药物都是生物大分子，其共同特点是在生物体内不稳定，易于被蛋白水解酶降解，因而在生物体内的半衰期较短，而且绝大部分不利于口服给药。,超氧化物歧化酶(SOD)能清除体内过量的超氧阴离子自由基损伤，但体内易于被蛋白酶水解破坏，当用脂质体包裹后，在生物体内的半衰期明显提高，而且脂质体能增加细胞对SOD的摄取能力，从而能更好地保护细胞免受自由基损伤。,Amderson等研究表明皮下注射游离IL-2的半衰期仅为6min，而脂质体包裹的IL-2为68min，且脂质体包裹的IL-2体内分布和药物代谢动力学发生很大改变。,胰岛素口服后由于胃酶和酸的破坏作用，生物利用度低，而用脂质体包裹后，可克服这些缺点，口服后动物血糖下降明显。,导向药物,以某种特异性抗体（或配体）为载体，将放射性同位素、细胞毒性药物、毒素等细胞毒性物质带到病灶处，特异性地杀伤靶细胞，这种具有导向性的细胞毒性物质称为,导向药物,。,2、生物传感器,传感器,是能将一种被测量的信号（参量）转化成为一种可输出信号的装置，通常由感受器、换能器和电子线路三部分组成。,生物传感器（biosensors）,就是用生物成分作为感受器的传感器。,待测物质经扩散作用进入生物活性材料，经分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的物理或化学换能器转变成可定量和可处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，便可知道待测物质的量。,酶传感器是发展最早，也是目前最成熟的一类生物传感器。它是在固定化酶的催化作用下，生物分子发生化学变化后，通过换能器记录变化从而间接测定出待测物浓度。,目前国际上已研制成功的酶传感器有20余种，其中最成熟的是葡萄糖传感器。使用时将酶电极浸入到样品溶液中，溶液中的葡萄糖即扩散到酶膜上，在固定于酶膜上的葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸，同时消耗氧气，通过氧电极测定溶液中氧浓度的变化，推测出样品中葡萄糖的浓度。,商品化实例：使用葡糖氧化酶的葡萄糖传感器,催化：葡萄糖+氧气+水 葡萄糖酸+双氧水,3 种有潜力的测试路径：,1)pH 变化（酸产物）,2)O2 消耗量（荧光检测）,3)H2O2 产物（电化学）,糖尿病是一种全世界范围内的疾病，影响着数百万人的健康，血液中葡萄糖含量的测定试进行糖尿病检测的一个必需的步骤，因为如果葡萄含量过高会使身体正常功能受到影响。葡萄糖氧化酶能够快速、简便的检测葡萄糖的含量，而且成本较低。,葡萄糖氧化酶是一个体积小但是很稳定的酶，能把葡萄糖氧化成葡萄糖酸内酯，同时把氧气氧化成过氧化氢。此酶主要的生物学功能集中在过氧化物的形成部位，过氧化氢是一种有毒的化合物能杀灭细菌。例如：在真菌表面发现的葡萄糖氧化酶能够防止细菌的侵染，在蜂蜜中发现的葡萄糖氧化酶作为一种天然的防腐剂发挥作用。,这个在自然调节中仅仅发挥着检测作用的不起眼的酶，却已经成了一个投资五十亿的生物科技公司的核心产业，葡萄糖氧化酶是用来检测血液中葡萄糖含量的生物传感器的核心部分。这些传感器的核心技术是利用葡萄糖氧化酶把不容易进行测定的葡萄糖转化成容易进行测定的过氧化氢。一个典型的实验使用的葡萄糖含量测定仪中包括嵌入薄膜的葡萄糖氧化酶。葡萄糖进入传感器就和葡萄糖氧化酶反应转化成葡萄糖酸内酯，同时铂电极检测到过氧化氢的形成，被检测样品中的葡萄糖越多形成的过氧化物就越多，电极的信号就越强。,当人们追溯动态血糖的历史，就不能不谈到Leland Clark 教授(1918-2005)，20世纪最伟大的科学家之一，生化传感器之父。他在1956年首次提出了氧电极与酶的还氧反应理论，并证实这种氧电极能够测量到大量的人体生物数据。这种氧电极，被后人称为：Clark电极或生化葡萄糖传感器。Clark博士是美国国家工程学院院士，一生获得了大量的美国和国际专利，先后发表了400多篇有关葡萄糖传感器的论文。根据Clark电极理论，自20世纪60年代开始，各国科学家纷纷开始葡萄糖传感器的研究，1975年,美国Yellow Springs Instrument Company首次研制出来了全球第一个商业用途的葡萄糖传感器，它就是目前被广泛应用到全球各地实验室的血液生化分析仪。1976年Anton Clemens 发明了第一个使用葡萄糖传感器的血糖仪，用于建立人工胰腺的实验。为此，动态血糖的问世，已经不再是技术问题了。1982年日本科学家Shichiri 首次应用皮下植入传感器开始人体试验。80年代末期，美国加州大学圣地亚哥分校(UCSD)开始糖尿病狗的传感器血糖检测动物试验。1999年全球第一个获得美国FDA批准的动态血糖监测系统问世。,