分批发酵和补料分批技术.ppt

儅僗僞乕僞僀僩儖偺彂幃愝掕,儅僗僞乕僥僉僗僩偺彂幃愝掕,戞 2 儗儀儖,戞 3 儗儀儖,戞 4 儗儀儖,戞 5 儗儀儖,*,发酵的方式有,:,(1),分批发酵,(Batch Fermentation)(2),补料分批发酵,(Fed-batch Fermentation)(3),连续发酵,(Continue Fermentation)(4),高密度发酵,(High Density Fermentation,）,(5),工程菌发酵,(Engineered Strain or Recombinant Strain Fermentation),第七章 分批发酵和补料分批技术,(Batch fermentation and Fed-batch fermentation),一,.,分批发酵,(,一,),分批发酵概况操作工艺,(,二,),分批发酵中的菌体生长规律,1.,典型的生长周期,2.,多底物培养基的生长,3.,线性生长和立方根生长,(,三,),分批发酵过程中的代谢变化,(,四,),分批发酵过程的最优化,(,五,),分批发酵的生产率,二 补料分批发酵（,Fed-batch Fermentation,）,1,补料分批发酵技术的含义,2,补料分批发酵与分批发酵，连续发酵的区别？,3,补料分批发酵技术的特点：,4,补料分批发酵技术的类型：,5,补料分批发酵的适用范围,6.,流加物料的方式,1,）恒定流速补料操作,2,）恒定底物浓度操作,3,）指数流速操作,7.,补料分批发酵技术的评价,一点重要的常识,分批发酵,是指生物反应器的间歇操作,在发酵过程中,除了不断进行通气,(,好氧发酵,),和为调节发酵液的,pH,而加入酸碱溶液外,与外界没有其它物料交换。这种培养方式操作简单,是一种最为广泛使用的方式。,分批发酵的主要特征是所有工艺变量都随时间而变化。主要的工艺变量是各种物质的浓度及其变化速率。,(,见下表,),分批发酵的思考,:,在分批发酵中,低浓度培养基中的营养物会迅速耗尽,引起培养物过早地从指数生长期向稳定期转变。,提高底物浓度的优点与不足,:,a.,提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期,从而提高发酵的容量,产率和产物浓度。,b.,提高底物浓度,(,对于某些可溶性碳源来说,微生物的,Ks,值多在,1-10,mg/L,范围内,当超过,10 Ks,或,10-100mg/L,时,微生物就会以接近最,大比生长速率,(max),的速度生长,),c.,过高的底物浓度会造成一系列不利影响,底物抑制,培养基粘度升高,引起传质效率降低等。克服此不足的方法就是采用,Fed-Batch,法,(,补,料分批技术,),。,（二）分批发酵中的菌体生长规律,微生物的生长包含两个含义,即：细胞的生长,微生物群体数量的增加,1.,典型的生长周期,分批培养是一个封闭的系统。接种后,除氧之外,一般都不向系统内添加和除去任何物质。因此,分批培养系统只能在一段时间内支持微生物的增殖。可以分为五个时期,:A,延迟期,B,对数生长期,C,减速期,D,静止期,E,衰退期,aaa,上式,下页有本公式变化式,C.,减速期,D,静止期,因营养物质耗尽或有害物质的积累,使细胞浓度不再增大,这一阶段为静止期或稳定期,.,在此期内,细胞浓度达到最大值,E,衰亡期,由于环境恶化,细胞开始死亡,活细胞浓度不断下降,这一阶段为衰亡期,.,有关衰亡期,:,另外,还有将其分为六个动力学区域的说法,:,和,Fig.,六个动力学区域,见下页图,。,3.,线性生长和立方根生长,在某些情况下，微生物会表现为线性生长（,linear growth),。线性生长时的菌体生长速度为一常数（,dX/dt=C,），而同菌体量无关。生长的线性特征是存在某种生长限制的表现。造成线性生长的可能原因很多，例如：酶浓度低而只表现恒定的活性；营养物质缺乏；外部或内部的传质限制等。由于供氧不足引起的线性生长是外部传质限制的典型例子（图）。增加体积氧传递系数（,K,L,a),就可以消除线性生长。,图：在分批发酵中，氧传递速度（,OTR,）对微生物生长的影响。提高体积氧传递系数可使微生物由线性生长（,1,）转变为指数生长（,2),菌体形态也会影响微生物的生长速度。丝状真菌可以以两种不同的形态生长：丝状生长和菌丝球生长。在液体深层发酵中，丝状生长可遵循指数生长规律，而菌丝球的生长由于受营养物质（主要是氧）扩散的限制而表现为立方根生长。,（三）分批发酵过程中的代谢变化,（,1,）,菌体生长阶段,亦称发酵前期或菌体生长期。发酵培养基接种后，产生菌在合适的环境中经过短暂的适应，即开始发育、生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。此阶段的代谢变化，主要是碳、氮源的分解代谢以及菌体细胞物质的合成代谢，二者有机地联系在一起。营养物质不断被消耗，新菌体不断合成，溶解氧水平不断下降。当营养消耗至一定程度，菌体生长至一定浓度，或者溶氧浓度下降至某一水平，即成为限制因素时，菌体生长速度减慢；同时，由于菌体内某些中间代谢产物迅速积累，原有的酶活力下降（或消失）以及出现与产物合成有关的新酶等原因，导致生理阶段的转变，即由菌体生长阶段转入产物合成阶段,。,（,2,）,产物合成阶段,亦称发酵中期或产物分泌期。此期以合成产物为主，产物生成速率达到最大，并一直维持到合成能力衰退。在此阶段中，菌体重量有所增加，但呼吸强度一般无显著变化。代谢变化以碳、氮源的分解代谢和产物合成代谢为主，二者有机的联系在一起，营养物质不断消耗，产物不断合成。此外，尚有合成菌体细胞物质的代谢存在，但不是主要的。一般在这个阶段必须将营养物质的浓度控制在一定范围内，以利于产物合成代谢的进行。如果营养物质多，则促进菌体生长，抑制产物合成；如果营养物质过少，则菌体易衰老，合成能力衰退，对生产不利。此外，发酵液的,pH,、温度、和溶氧浓度都会影响发酵过程中的代谢变化，从而影响产量，必须予以严格控制。,(,四,),分批发酵过程的最优化,1,.,分批发酵的最优目的,:,以最小的费用获得最大产量。,生产成本,:,原料费,+,操作费,(,通气费,+,搅拌费,),最优化的目标函数,:,可以取产量,(,对反应器而言,就是最终产物浓度,P),生产率,(,单位时间的平均产量,P,i,V/t,i,),纯利润等。也可用其中的两个进行多目标函数优化。,（,3,）,菌体自溶阶段,亦称发酵后期或菌体自溶期。此阶段菌体衰老，细胞开始自溶，合成产物能力衰退，生产速率下降，,NH,2,-N,增加，,pH,上升。此时发酵必须结束，否则不仅会使抗生素受到破坏，还会给发酵液过滤和提炼带来困难。,根据发酵过程中,C,、,N,、,pH,、菌体重量和产物浓度等参数的变化，可以做出发酵过程中的代谢曲线。代谢曲线能够很清楚地表明发酵过程中的代谢变化，并反映,C,、,N,的利用和,pH,、菌体重量及产物浓度等参数之间的关系。对代谢曲线进行分析研究，有利于掌握代谢变化的规律及发现工艺控制中存在的问题，有利于改进工艺，提高产量。,1.,培养基配方的最优化,微生物生长需要许多营养物质，这些营养物质共同影响着菌体生长和代谢产物的生成。微生物的培养基配方一般是先参考以往的报道或根据经验确定的。有必要研究所用培养基的各组分含量是否必要或者是否充分利用了。在分批培养中，所有的培养基组分一次投入，不在中途调节和控制其浓度，因而底物浓度一直下降，变化幅度很大。无论,rx,、,rs,、,rp,等速率参数在反应中与底物浓度有怎样的对应关系，仅根据化学计量关系确定营养物的初始浓度，也是比较合理的。即预先设定,X,st,为最大菌体浓度，则可得底物,Si,的初始浓度为：,(8.12),无机离子或生长因子等一旦被细胞吸收，在细胞内保持原化学状态，且含量恒定不变。这类营养物质称为储存性底物。可根据这些物质在菌体内的实际含量，用类似于式（,8.12,）的方法确定其需要量。,代谢产物的产量与培养基配方之间的关系很复杂，不能用解析函数形式表示时，可采用实验设计法确定最优初始浓度。实验设计法的详细介绍可参阅有关专著。,意义,利用最有实验设计法，即使不能提高产量，也可以探索培养基组分的最小需要量，从而避免不必要的浪费。,2.,反应温度的最有化,分批发酵微生物反应过程中，并非一定要一直保持恒温，因为微生物生长的最适温度不一定与代谢产物的最适温度相同。例如生产青霉素的青霉属（,Penicillium),霉菌的生长速率大约在,30,时最大，而青霉素合成速率却在较低温度（,15-20,）时最大。一般在二者之间的中间值（,35,）进行给定值恒温控制。下面介绍,Constantinides,等用最优化原理进行温度最优化的结果。,为了运用最优化控制理论，需要建立描述对象系统状态特征的数学模型。若数学模型不能正确表达系统的特征，得到的最优解事不可靠的，因此，数学模型必须尽可能正确。检验模型可靠性的过程称为模型识辨。必须重视模型辨识。,Constantinides,等运用统计学方法比较了青霉素发酵的集中模型的适用性后，采用了如下模型：,青霉素生产菌的增长方程,（五）分批发酵的生产率,体积生产率是以每小时每升产物的克数来表示的（,g,产物,/L*h,）,也是过程综合性能的变量。在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率。其时间不仅包括发酵时间，而且也包括把上一批料液从发酵罐放尽的时间、罐内洗涤以及新鲜培养基放入和消毒所需要的时间。这种时间间隔有长有短，在制备酵母时可短至,6h,，在抗生素生产中可长达,20h,。图,8-5,表示整个发酵周期的一种典型剖析。从起点到发酵重点以直线斜率表示总的生产率，通过原点并与生长曲线相切的相似直线表示最大的生产率，这是发生在一种细胞或者产物浓度比最大值小的时候。,总大叫时间可以有方程式（,8.17,）计算,;,(8.17),式中,t,T,、,t,L,和,t,D,指转移、停滞和搁置（如对培养基分批转料及消毒）的时间，,X0,和,Xt,是细胞最初和最终浓度。因此，总生产率,P,可以用方程式（,8.18,）来表示：,(,8.18),从这个方程式可以测定过程变化对总的生产率的影响。种子量较大 时，,X0,增大，过程缩短。转移或搁置时间减少，同样也缩短周期，如应用一种促进生长的种子培养物可以消除停滞期。倘若发酵周期较短（如：,18-48h),像面包酵母和谷氨酸生产，转移时间对总的生产率来讲显得很重要。另一方面，对于长发酵周期来说（例如,150-200h),如在抗生素生产中，几小时的差别没有很大意义。,二,.,补料分批发酵（,Fed-batch Fermentation,）,1,补料分批发酵技术的含义,在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统中补加一定物料的培养技术。通,过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的底物浓度较长时间地保持在一定范围,内，即保证微生物的 生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高容量产率，产物,浓度和得率的目的。,2,补料分批发酵与分批发酵，连续发酵的区别？,补料分批发酵是介于分批发酵和连续发酵之间的发酵形式；区别于分批发酵技,术：由于补加物料，补料分批发酵系统不一再是封闭系统；区别于连续发酵技术：,补料分批系统并不是连续地向外放出发酵液，罐内的培养液体积（,V,）不再是个常数,，而是随时间（,t,）和物料流速（,F,）而变化的变量（变体积操作）。,3,补料分批发酵技术的特点：,由于基质的缓慢补入，既满足了微生物生长和产物合成的持续需要，又要避免,了由于基质过量引起的各种调控反应，从而能使产率获得很大提高；,补料技术本身的提高：少次多量,少量多次,流加,微机控制流加；整,个发酵过程中不断地调节补料率，维持各项物质的供需平衡。,4,补料分批发酵技术的类型：,据补入物料的组成：,*完全补料培养,补入成分完全的培养基,*半分批补料培养,仅补人一种或几种限制性营养成分,据物料流入（,Fin,）和流出（,Fex,）发酵罐的速率,，补料分批分为多种形式：,*分批发酵（,Fin=Fex=0,）分为五种方式见下页,*,*,连续发酵（,Fin=Fex=0,）（恒体积操作）,据操作方式,：,*近似恒体积操作,让补料的容量流速似近于蒸发速率，由于蒸发速率,较慢，要补加高浓度溶液或直接补入液体或固体物料本身，满足微生物,的生长需要。,*增加体积操作（,Fex=0,）,由于发酵液体积的不断增大和产物积累造,成生长抑制，为保持产量只能延长发酵时间。,*重复循环操作（,Fex=0,）,为缩短发酵时间，定期从发酵罐中排出一,定量的发酵液，以便能进一步补加物料，连续发酵,也是重复循环补,料培养的一种极限情况（,Fin=Fex=,定值）。,1.,恒定流速补料；,2.,延长培养；,3.,指数流速补料,5,补料分批发酵的适用范围,1,）高菌体浓度培养（高密度培养）系统；,2,）存在高浓度底物抑制的系统；如苯酚等，通过流加底物降低抑制。,3,）存在,Crabtree,效应的系统（酵母培养中，初糖过高，即使溶氧充足，也,会产生乙醇，影响菌体得率）；,4,）受异化代谢物阻遏的系统（葡萄糖作碳源时，分解代谢物抑制异化代谢有关的酶合成）；,5,）利用营养突变体的系统；,6,）希望延长反应时间或补充损失水分的系统。,Note:,Crabtree,效应：,在酵母培养中，糖浓度过高，即使溶解氧很充足，也由糖,生成乙醇，从而使菌体得率下降的现象。,细菌,Crabtree,效应：,细菌需氧培养中糖浓度过高生成副产物如醋酸等有机,酸，抑制菌体生长。,异化代谢物阻遏：,指利用葡萄糖等容易被利用的碳源分批培养时，某种酶,尤其是与异化代谢有关的酶的生物合成抑制的现象。也称为分解代谢物抑,制作用。,6.,流加物料的方式,连续补料工艺中，有三种流加方式，,1,）恒定流速补料操作,由于补料速度是定值，操作简便，设备简单，是最常用的流加方式，发酵液,体积呈线性增长。由于在指数生长期，微生物的底物消耗也呈指数增加，恒定流,速补料不能维持底物浓度不变。底物浓度会随时间延长而逐步降低。,2,）恒定底物浓度操作,恒定底物浓度补料操作又称延长培养，是指用一定的方式连续补料，维持限,制性底物浓度恒定的一种操作。,3,）指数流速操作,指数流速补料操作能在短时间内获得最大量细胞，还可通过变更流速指数来,控制比生长速率。,7.,补料分批发酵技术的评价,补料分批培养是介于分批培养和连续培养之间的一种微生物细胞培养方式，,它兼有两种培养方式的优点，并在某种程度克服了它们所存在的缺点。,（见下页表）,二,.,补料分批发酵（,Fed-batch Fermentation,）,1,补料分批发酵技术的含义,2,补料分批发酵与分批发酵，连续发酵的区别？,3,补料分批发酵技术的特点：,4,补料分批发酵技术的类型：,5,补料分批发酵的适用范围,6.,流加物料的方式,1,）恒定流速补料操作,2,）恒定底物浓度操作,3,）指数流速操作,7.,补料分批发酵技术的评价,8.,补料的目的及其意义,a.,维持菌体正常代谢，推迟自溶期；,b.,延长产物合成期；,c.,可以维持较高的产物增长幅度；,d.,增加发酵液总体积；,e.,纠正异常发酵，控制,pH,，代谢方向。,如：四环素发酵生产时：不补糖，周期,7296h,，产率：,5.57kU/ml,补糖时，周期,120130h,，产率：,1012kU/ml,9.,补料的控制,1,）无反馈控制操作,恒定流速补料和指数流速补料属于此类，,无反馈控制操作是补料流速,不随培养液变化而变化，人为地预先设定好。,2,）反馈控制操作,恒定底物浓度操作属于此类，,反馈控制操作是通过传感器直接测量培,养物生长的特定参数，进而根据参数的变化来调节物料向培养物中补加的,速率，使培养物参数保持恒值或最优值。,*,反馈控制分为：直接法和间接法；,a.,直接法：以限制性底物（,C,，,N,，,C/N,）浓度为反馈控制参数；,b.,间接法：以,DO,，,pH,，呼吸商，排气中,CO2,分压，代谢产物浓度为反馈参数。,*反馈控制系统的组成：传感器，控制器，驱动器，补料系统等；,10.,不同培养基组成采用各种自动流加控制指标：,工业上所用的培养基组成是各种各样的，见下页表。,（二）补料分批发酵动力学,1.,补料分批发酵,通常用下列方程式来定量地表示连续补料工艺的参数变化：,线性补料：,Fin(t)=,1,t+,1,指数补料：,Fin(t)=,2,e,2t,培养液体积：,V,（,t,）,=V,0,+Fin t,dV/dt=Fin(t,)-(H1),和,是常数，当用恒定物速补料时，,1,=0,，,V,0,为起始培养液体积。,如果：连续补料系统具有以下特征：,（,1,）充分混合的反应器；（,2,）单一限制性底物；（,3,）平衡生长,（,4,）恒定的得率系统（,Y,）；（,5,）符合,Monod,动力学方程。,那么：菌体总量的瞬时变化可表示为：,d(VX)/dt=(dV/dt)X+(dX/dt)V=XV-,-(H2),从,H1,和,H2,可得到：,dX/,dt=X (F,in,/V)X=(maxS)/(ks+S)X-(Fin/V)X-(H3),Note,：,-(Fin/V)X,代表由于物料流入引起体积变化而造成的菌体浓度的降低。,由于：,X,=r,x,所以：,r,s,=-(1/Y)r,x,那么：,dS/dt=(S,in,-S)(F,in,/V)-(,max,S)/,（,k,S,+S,）,X/Y,-(H4),Note,：,S,in,为补料液的底物浓度。,连续发酵中，稀释率（,D=F/V,）是一常数；,恒定流速的补料分批发酵中，连续补料引起体积（,V,）增加，稀释率,(F,in,/V),相应地减小。由于,H3,和,H4,与恒化器的动力学方程相同，,恒定流速,体积增加的补料分批发酵相当于体积恒定流速降低的恒化器培养。,准稳态：,当补料速度非常低，使得比生长速率,约等于稀释率,F,in,/V,的动力,学稳定态现象。准稳态时,约等于,D,，但不是固定不变的，而是以相同的速,率下降。由于：,=Fin/V,根据方程,H3,，此时,X,为恒值,(dX/dt=0),，但是,dS/dt=0 S,随时间而下降，,S=(F,in,/V)Ks/(,max,（,F,in,/V)=DKs/(,max,D),对恒定流速的补料分批发酵而言：,d(VX)dt=F,in,X=,常数,准稳态时的总菌体量的变化速率为常数，微生物表现为线性生长。,dX/,dt=X (Fin/V)X=(maxS)/(ks+S)X-(Fin/V)X-(H3),2.,重复,补料分批发酵,如果在补料分批培养的基础上加以改进，在培养过程中从某个时候起，每隔一定时间取出一定体积的培养液，同时在同一时间间隔内加入一定体积的培养基（含有限制生长基质），这就是重复补料分批发酵。,采用此方式，培养液体积、稀释率、比生长速率等与代谢有关的参数都将发生周期性变化。,补料的计算机控制！,