医学分子生物学-上课用-12.基因诊断.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,2025/11/14 周五,1,第一节 基因诊断基础,第二节 遗传病的基因诊断,第三节 传染病的基因诊断,第四节 肿瘤的基因诊断,第五节 基因诊断在法医学上的应用,本章内容提要,2025/11/14 周五,2,基因诊断之父,简悦威,1976,年加州大学华裔科学家,Kan YW,用核酸分子杂交技术首次对一例,地中海贫血进行诊断。,Yuet Wai Kan,1936,第一节,基因诊断的技术和方法,2025/11/14 周五,3,一、基因诊断的概念、特点及临床意义,基因诊断,：,就是用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子是,DNA,、,RNA,或者,蛋白质,。,2025/11/14 周五,6,二、基因诊断中常用的分子生物学技术,核酸分子杂交（,Nucleic acid hybridization,）,聚合酶链式反应,(PCR),单链构象多态性（,SSCP,）,限制性片段长度多态性（,RFLP,）,DNA,序列测定（,DNA sequencing,）,生物芯片（,biochips,）,Western,免疫印迹（,Western blot,）,免疫组织化学诊断,2025/11/14 周五,7,（一）核酸分子杂交,指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。,2025/11/14 周五,8,核酸分子杂交流程,待测核酸制备,滤膜上核酸固化,杂交,去除未杂交的探针,检测杂交信号,核酸探针制备,探针标记,加入标记探针,2025/11/14 周五,9,提取,DNA,限制性内切酶消化,DNA,以产生特定长度的片段凝胶电泳分离 变性处理,DNA,转印到膜上并使其牢固结合,将标记的探针与膜上,DNA,片段杂交，分析杂交信号。,1.Southern,印迹杂交,2025/11/14 周五,10,RNA,经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交检测特定的,mRNA,分子的含量与大小。,2.Northern,印迹杂交,2025/11/14 周五,11,3.,斑点杂交（,dot blotting,）,将,RNA,或,DNA,变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及定量的研究。,2025/11/14 周五,12,4.,反向斑点杂交,先,将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜,上，将样品,RNA,或,DNA,标记变性后进行杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只能检测一种样品的局限，大大提高了基因诊断的效率,。,2025/11/14 周五,13,寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，可用人工合成的,针对正常和突变,ASO,探针进行反向斑点杂交,，检测,点突变,，,大大提高检测结果的可靠性。,等位基因特异性寡核苷酸,(allele specific oligonucleotide,ASO,）,2025/11/14 周五,14,ASO1,ASO2,N,H,M,G,A,G,C,A,C,A,T,G,T,N,：正常基因；,H,：杂合子基因；,M,：突变基因,2025/11/14 周五,15,5.,原位分子杂交,荧光原位杂交,(fluorescence,in situ,hybridization,FISH,）,2025/11/14 周五,16,荧光原位杂交（,FISH,）,2025/11/14 周五,17,（二）,聚合酶链式反应,(,polymerase chain reaction,PCR,）,模板,引物,dNTP,Mg,2+,Taq,DNA,聚合酶,变性,延伸,退火,2025/11/14 周五,18,基因诊断中常用的,PCR,衍生技术,:,RT-PCR,荧光定量,PCR,多重,-PCR,PCR-ASO,AS-PCR,PCR-SSCP,PCR-RFLP,2025/11/14 周五,19,1.RT-PCR,2025/11/14 周五,20,2.,荧光定量,PCR,荧光标记引物,2025/11/14 周五,21,3.,多重,PCR,多重,PCR,示意图,A,：普通,PCR,；,B,：多重,PCR,2025/11/14 周五,22,4.PCR-ASO,ASO1,ASO2,N,H,M,G,A,G,C,A,C,A,T,G,T,N,：正常基因；,H,：杂合子基因；,M,：突变基因,2025/11/14 周五,23,5.AS-PCR,（,allele specific PCR,）,等位基因特异,PCR,：根据引物,3,端的互补与否，设计,一对与正常或突变模板配对的特异引物,.,2025/11/14 周五,24,（三）单链构象多态性分析,(,single-strand conformation polymorphism,，,SSCP,),DNA,的突变造成,DNA,片段中碱基序列不同，变性为单链后在,中性聚丙烯酰胺凝胶,中的,构象不同,（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。,2025/11/14 周五,25,PCR-SSCP,分析原理,2025/11/14 周五,26,正常人,纯合突变,杂合突变,+,PCR-SSCP,分析,2025/11/14 周五,27,（四）限制性片段长度多态性分析,（,restriction fragment length polymorphism,RFLP,）,由于,DNA,变异,产生新的酶切位点,或,原有的酶切位点消失,，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。,可借助核酸分子杂交或,PCR,进行检测。,2025/11/14 周五,28,A,B,C,D,E,F,G,GAATTC,CTTAAG,F,EcoR,限制性内切酶位点的变化,E,B,G,C+D,A,D,E,F,B,G,C,A,2025/11/14 周五,29,GAATTC,CTTAAG,基因组,DNA,的,E.coR,酶切电泳图谱,2025/11/14 周五,30,PCR-RFLP,设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在,PCR,扩增后用该限制酶切割,PCR,产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。,2025/11/14 周五,31,（五）,DNA,序列测定（,DNA sequencing,）,2025/11/14 周五,32,DNA,序列测定原理,(,双脱氧末端终止法,),2025/11/14 周五,33,左侧：正常；右侧：突变,序列分析用于基因诊断,2025/11/14 周五,34,（六）生物芯片（,biochip,）,基因芯片,（,gene chip,）,蛋白质芯片,（,protein chip,）,基因芯片杂交流程示意图,2025/11/14 周五,35,基因诊断中常用的分子生物学方法比较,方法,基本原理,核酸分子杂交,错配时杂交信号减弱或消失,PCR,变异引起扩增产物不同,SSCP,突变引起核酸二级结构改变,RFLP,基因变异改变酶切图谱,DNA,测序,序列比对寻找差异,生物芯片,多元杂交寻找信号差异,2025/11/14 周五,36,三、基因诊断技术路线与方法,直接诊断,：直接分析致病基因分子结构及表达是否异常,间接诊断,：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析,2025/11/14 周五,37,（一）直接诊断途径,必要条件：,被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系,;,被检基因正常分子结构已被确定,;,被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）已知,.,2025/11/14 周五,38,5,/,5,/,3,/,3,/,RFLP,点突变的检测,（,1,）有限制性内切酶位点改变,39,-,珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子,17,突变的检测,M,：,pBR322 DNA/,Msp,I;,1:,未酶解片段；,2,：,A,/,A,；,3,：,A,/,T,；,4,：,T,/,T,注：由于,54bp,、,114 bp,、,72 bp,片段及分子量标准中低于,200 bp,的片段太小，在,0.8,的琼脂糖凝胶中不易被观察到,PCR-RFLP,分析,-,珠蛋白生成障碍性贫血症,2025/11/14 周五,40,斑点杂交、反向斑点杂交,AS-PCR,、,PCR-SSCP,、,PCR-ASO,、,PCR,产物直接测序,5,5,3,3,（,2,）无限制性内切酶位点改变,2025/11/14 周五,41,在,DNA,序列上有一段,较长序列,的重新排布。包括数十个碱基到数千个碱基的,丢失,、,插入,、,替换,、,重复,和,倒位,等，以及染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等,.,2.,基因重排的检测,核酸分子杂交与,PCR.,42,-,基因不同程度缺失引起不同类型的,-,地贫,1,2,正常,基本,正常,+,轻度,贫血,+,+,轻度,贫血,0,高度贫血,+,0,Hb Barts,综合征,0,0,2025/11/14 周五,43,Bam,HI,Bam,HI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,-,珠蛋白生成障碍性贫血,的直接基因诊断,-,珠蛋白,基因不同程度的缺失可引起,不同类型的,-,珠蛋白生成障碍性贫血,2025/11/14 周五,44,-,珠蛋白生成障碍性贫血,的直接基因诊断,aa/aa,aa/a-,aa/-,a-/a-,a-/-,-/-,14kb,10kb,正常,缺,1,缺,2,缺,2,缺,3,缺,4,2025/11/14 周五,45,3.,基因表达异常的检测,mRNA,的定量或长度分析,：,RT-PCR,、,Northern,印迹杂交、定量,RT-PCR,等。,蛋白质变化,：,Western Blot.,2025/11/14 周五,46,（二）间接诊断途径,1.,采用原因：,(1),致病基因未知或基因结构不确定,(2),致病突变机理不清,(3),致病位点不便检测,间接诊断：检测与致病基因连锁的,遗传标记,。,2025/11/14 周五,47,2.,遗传标记,DNA,多态性：,指群体中的,DNA,分子存在至少两种不同的类型，即,个体间同一染色体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异或变异,。,多在进化中形成，本身并不致病，只是与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。,2025/11/14 周五,48,三代遗传标记：,RFLP,VNTR;STR,SNP,2025/11/14 周五,49,7.6 kb,13 kb,患者,正常,(1)RFLP,标记的连锁分析,镰状红细胞性贫血病,(HBS),的间接基因诊断,Hpa,7.6 kb,13 kb,Southern,印迹杂交,N H P,N,：正常；,H,：杂合子；,P,：患者（纯合子）；黄色区域为探针,2025/11/14 周五,50,重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其,重复次数在人群中存在变异，形成多态性,。,串联重复序列散在分布于染色体上。,重复单位为,6,25 bp,，称为,小卫星,DNA,。,重复单位为,2,6 bp,，如（,TA,）,n,(CGG)n,等，称为,微卫星,DNA,。,（,2,）串联重复序列长度多态性分析,2025/11/14 周五,51,串联重复序列长度多态性分析,串联重复序列两侧含有一些核酸限制性内切酶的酶切位点，切割后产生不同长度的,DNA,片段。,串联重复序列两侧序列是保守的，可设计特定引物进行,PCR,，,PCR,产物长度不同。,2025/11/14 周五,52,第二节 遗传病的基因诊断,一、血红蛋白病（,hemoglobinopathy,）,（一）镰状细胞贫血病,（二）,-,珠蛋白生成障碍性贫血症,二、血友病（,Hemophilia,）,甲型血友病,三、脆性,X,综合征,2025/11/14 周五,53,正常（,N,）的,ASO,探针：,5-ACT CCT G,A,G GAG AAG TCT GC-3,突变（,M,）的,ASO,探针：,5-ACT CCT G,T,G GAG AAG TCT GC-3,1.,镰状细胞贫血病的,ASO,杂交法检测,一、血红蛋白病,（一）镰状细胞贫血病,2025/11/14 周五,54,斑点杂交结果，,N,：正常；,M,：突变,N-ASO,M-ASO,正常 突变 突变纯合子 杂合子 纯合子,2025/11/14 周五,55,5,3,正常基因,1.15 kb,(CCT G,A,G G),5,3,突变基因,1.35 kb,(CCT G,T,G G),Mst,酶切位点,（,CCTNAGG,）,2.,镰状细胞贫血病的限制性内切酶谱分析,2025/11/14 周五,56,0.2 kb,1.15 kb,1.35 kb,正常人,携带者,患者,镰状细胞贫血病的限制性内切酶谱分析,2025/11/14 周五,57,3.,镰状细胞贫血病的,的,PCR-RFLP,分析,正常人的扩增产物经,Mst,消化可生成,54 bp,和,56 bp,两个片段（,1,），而镰状细胞贫血症患者的,DNA,片段不被酶切，仍为,110 bp,（,2,），杂合子可见三条带（,3,）,2025/11/14 周五,58,1.PCR-RFLP,分析,-,珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子,17,突变的检测,M,：,pBR322 DNA/,Msp,I;,1:,未酶解片段；,2,：,bA/bA,；,3,：,bA/bT,；,4,：,bT/bT,注：由于,54bp,、,114 bp,、,72 bp,片段及分子量标准中低于,200 bp,的片段太小，在,0.8,的琼脂糖凝胶中不易被观察到,（二）,-,珠蛋白生成障碍性贫血症,2025/11/14 周五,59,-,珠蛋白生成障碍性贫血症,的反相斑点杂交分析,2.,反相斑点杂交,2025/11/14 周五,60,二、血友病（,Hemophilia,）,甲型血友病是由于血浆凝血因子,V,（,FV,）缺陷造成。,甲型血友病的基因突变类型已有,300,余种，其中点突变占,174,种；另有部分患者是由于缺失或插入突变或内含子,22,的基因倒位所致。,2025/11/14 周五,61,1.FV,基因倒位,的,DNA,印迹分析,将基因组,DNA,用,Nco,I,，,Dra,I,或,Bcl,I,等内切酶（酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行杂交分析，正常人表现为,21.5 kb,、,14 kb,和,16 kb,三种类型。,I,型倒位患者表现为,20,、,17.5,和,14 kb,三种类型；,型倒位患者表现为,20,、,16,和,15.5 kb,三种带型。在一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。,2025/11/14 周五,62,2.FV,基因突变,的检测,（,1,）依赖于,FV,基因内或旁侧的多态性标记的连锁分析,（,2,）,RFLP,连锁分析,（,3,）,VNTR,分析,（,4,）短串联重复序列（,STR,）的连锁分析,63,三、脆性,X,综合征,脆性,X,智力低下基因,1,（,FMR1,）,5,非翻译区遗传不稳定的,(CGG)n,重复序列的异常扩增,以及相邻,CpG,岛的异常甲基化,。,正常人中约为,8,50,拷贝。,携带者增多到,52,200,拷贝，相邻的,CpG,岛未被甲基化，称为前突变,.,男性患者和脆性部位高表达的女性中，达到,200,1000,拷贝，相邻的,CpG,岛也被甲基化，称为全突变,.,全突变可关闭相邻,FMR1,基因的表达，,FMR1 mRNA,在几乎所有患者不表达或只有低表达，从而出现临床症状。,2025/11/14 周五,64,脆性,X,综合征常用基因诊断方法：,1,PCR-ASO,2,DNA,连锁分析,3,Southern,印迹杂交法,4,PCR,扩增,2025/11/14 周五,65,一、病毒性疾病,甲型肝炎病毒（,HAV,）,HAV,系,RNA,病毒，利用,RT,PCR,技术可从粪便中检测出甲型肝炎病毒的基因组,RNA,。,乙型肝炎病毒（,HBV,）,设计保守区序列引物，扩增各型,HBV DNA,片段；设计位于可变区的引物扩增某一亚型,HBV DNA,，以便分型。,丙型肝炎病毒（,HCV,）,HCV,为正链,RNA,病毒，先逆转录成,cDNA,，再进行巢式,PCR,检测,HCV,。,第三节 传染病的基因诊断,2025/11/14 周五,66,二、细菌引起的疾病,结核分枝杆菌,先设计一对特异性引物，用,PCR,技术扩增出一,383 bp,序列，再用探针杂交，灵敏度可达到,100,个细菌水平。,幽门螺杆菌（,HP,）,主要采用,PCR,技术：检测,HP,染色体,DNA,特异片段；检测,HP,尿素酶,A,基因；用,PCR-RFLP,鉴别,HP,菌株。,2025/11/14 周五,67,三、寄生虫及衣原体感染,疟原虫,卡氏肺孢子虫,衣原体感染,诊断方法：核酸杂交和,PCR,技术,2025/11/14 周五,68,第四节 肿瘤的基因诊断,一、原癌基因与抑癌基因的检测,如,原癌基因,K-ras,第,12,密码子点突变：,GGT-TGT/GTT/GAT/GCT,；,抑癌基因,p53,密码子,130290,之间的基因突变。,二、常见肿瘤的基因诊断,BRCA,基因突变与乳腺癌的易感性有关。,APC,是结肠癌发生过程中第一个突变基因。,2025/11/14 周五,69,一、原癌基因与抑癌基因的检测,1,原癌基因的检测：,ras,基因家族由,H-ras,、,K-ras,和,N-ras,组成。最常见的突变是第,12,、,13,、,59,或第,61,位密码子的点突变。,胰腺癌、结肠癌、肺癌以,K-ras,突变为主，如第,12,位密码子突变，由编码甘氨酸的,GGT,突变为,TGT,、,GTT,或,GAT,，少数突变为,GCT,。,急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以,N-ras,突变为主；,泌尿系统肿瘤则以,H-ras,突变为主。,2025/11/14 周五,70,2.,ras,原癌基因突变常用的检测方法：,PCR,及,PCR-SSCP,分析,：扩增,ras,基因第,12,位密码子点突变部位，再用,SSCP,技术进行分析，或者直接测序确定患者,ras,原癌基因的点突变。,核酸杂交技术,（如,ASO,）：检测,ras,基因第,12,位密码子点突变。,2025/11/14 周五,71,3,抑癌基因,p53,的检测：,p53,基因以密码子第,175,位、第,248,位、第,249,位、第,273,位及 第,282,位点突变率最高。在结直肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，都可见异常的,p53,基因蛋白。,p53,的基因诊断方法有：,（,1,）,PCR-SSCP,（,2,）,DNA,序列分析,（,3,）,PCR-RFLP,2025/11/14 周五,72,（一）乳腺癌,1,乳腺癌常见基因变异,5%,10%,乳腺癌患者有家族遗传性。乳腺癌高危家族中常有,抑癌基因的,BRCA,基因,（,breast cancer gene,）的突变。,BRCA1,突变易致乳腺癌。突变分布于整个编码序列，没有明显的突变簇或突变热点。,70%,的缺失或插入导致编码序列的框移和翻译提前终止。,BRCA1,在,N,端的一半部位截短，与乳腺癌和卵巢癌的高风险相关；而在,C,端截短则主要与乳腺癌高危有关。,BRCA2,基因在,30%,40%,的散发性乳腺癌有杂合性缺失（,LOH,）。突变提高乳腺癌易感性。,二、常见肿瘤的基因诊断,2025/11/14 周五,73,2,乳腺癌基因诊断方法,（,1,）,PCR,法检测,BRCA1,基因突变,（,2,）荧光原位杂交（,FISH,）检测,BRCA2,基因扩增。,2025/11/14 周五,74,（二）结肠癌,1.,结肠癌常见基因变异,在癌发展过程的不同阶段发生不同的基因突变。,APC,是结肠癌发生过程中第一个突变基因。,K-,ras,原癌基因突变也是结肠癌形成的早期事件。,DCC,基因失活是结肠癌发展的晚期事件。抑癌基因,DPC4,和,MADR2,也可能会因,18q,等位基因丢失而失活。,p53,基因的突变是结肠癌发展过程的晚期现象。,DNA,修复基因也与结肠癌有关。如,hMSH2,、,hMLH1,、,hPMS1,或,hPMS2,基因的突变所致的,DNA,错配修复缺陷与遗传性非息肉性结肠癌的发生有关。,2025/11/14 周五,75,2,结肠癌基因诊断方法,（,1,）,PCR-SSCP,法：对腺瘤样息肉病人,APC,基因,PCR-SSCP,技术进行分析。,（,2,）异源双链,PCR,法：检测,APC,基因变异。,（,3,）蛋白质免疫印迹法：检测因基因突变而缩短了的,APC,蛋白。,2025/11/14 周五,76,第五节 基因诊断在法医学上的应用,2025/11/14 周五,77,重复序列以各自核心序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。,串联重复序列散在分布于染色体上。,重复单位为,6,25 bp,，称为,小卫星,DNA,。重复单位为,2,6 bp,，如（,TA,）,n,(CGG)n,等，称为,微卫星,DNA,。,一、,DNA,指纹与多态性遗传标记,2025/11/14 周五,78,可变数目串联重复序列,(VNTR),人类染色体上,小卫星,DNA,的高度可变区（,HVR,）是由头尾相连的串联重复序列（,tandem repeat,，,TR,）组成，,TR,的核心序列同源性很高，等位,HVR,的长度由于,TR,的重复次数不同而有很大的差别，具高度多态性。,2025/11/14 周五,79,DNA,长度多态除可用,Southern,印迹杂交法检测外，还可以通过,PCR,扩增后电泳来检出。,扩增片段长度多态性,(amplified fragment length polymorphism,AFLP),2025/11/14 周五,80,1985,年，英国遗传学家,Jeffeys,等人用,TR,的核心序列为探针,进行,RFLP,分析时，所得图谱具有高度的个体特异性，达到了如同人类指纹那样的高度专一性，所以称其为,DNA,指纹图谱,（,DNA fingerprinting,）。,Alec John Jeffreys,Oxford,United Kingdom,第五节 基因诊断在法医学上的应用,2025/11/14 周五,81,人类,DNA,指纹图,2025/11/14 周五,82,二、,DNA,指纹与法医学诊断,个体识别和亲子鉴定,：,DNA,指纹技术是从基因水平检测,DNA,的高度多态性，个体识别率高。,以往在刑事案件的,法医学鉴定,中应用的是血型、血清蛋白型、红细胞酶型和,HLA,分型，个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统一认证。,2025/11/14 周五,83,1,单位点探针检测及,PI,值的计算,父权指数（,Paternity Index,，,PI,）值,、父权相对指数或亲子关系概率值计算方法基本一致。,PI,值表示争议父作为亲父比随机男人作为亲父的可能性大多少倍，,PI,值大于,1,表示倾向肯定父子关系，数值越大，可能性越大；等于,0,时表示排除父子关系,。,2025/11/14 周五,84,2,DNA,指纹图与亲权鉴定,多位点,VNTR,系统和,DNA,指纹图的电泳分离后片段数目较多，各等位基因频率分布的计算复杂，进行亲权鉴定和个体识别时匹配概率的计算影响因素较多，目前尚无一个公认的最合理的计算方法。,目前解决亲权纠纷最简单的办法是先在孩子,DNA,指纹图中找出非母片段并计数为,P,，然后分析争议父,DNA,指纹图，看,P,条非母带在争议父中出现多少条。,2025/11/14 周五,85,亲权鉴定与,DNA,指纹图,由此图可推断出：,A,和,C,是亲生女儿；,B,为妻子和其前夫所生；,D,为养女。,2025/11/14 周五,86,法医案检中的基因诊断技术,VNTR,（可变数目串联重复序列,/,小卫星）的核酸分子杂交分析,STR,（短串联重复序列,/,微卫星）的,PCR,分析,SNP,的基因芯片检测,