微生物学实验—张小葵、赵丽华.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微生物学实验,*,实验步骤,配培养基（,250ml/,组）,牛肉膏蛋白胨培养基（,P50,、,P214,）,高氏,号培养基（,P54,、,P214,）,查氏培养基（,P214,）,包扎移液管（,1,支,/,人）、培养皿（,4,皿,/,人），做棉花塞。,分装入试管（,2,个,/,人）和,500ml,三角烧瓶内（,1,个,/,组），注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。固体分装的装量不超过管高的,1/5,，灭菌后取出斜躺凝固成斜面。,在试管（捆扎好）、三角烧瓶的棉塞外包两层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞。注明培养基名称、组别、日期等。,微生物学实验,实验二、消毒(disinfection)与灭菌(sterilization),实验目的,了解湿热灭菌、干热灭菌和紫外灭菌的原理和应用范围,学习各种灭菌方法的操作技术,实验原理（略）,实验步骤,将包扎好的移液管、培养皿放入干热灭菌箱内，,160,，,2h,。,将包扎好的试管、锥形瓶放入高压蒸汽灭菌锅，,121,，,20min,。,灭菌结束，摆斜面,(,1/2),，备用。,超净工作台紫外灭菌,30min,。,微生物学实验,实验三、普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色,实验目的,了解普通光学显微镜的结构、基本原理,掌握油镜的正确使用方法,掌握简单染色法的原理及操作步骤,微生物学实验,实验步骤,涂片,干燥,固定,(,在微火上通过,34,次,),染色（染色,1min,）,冲洗,吸干,镜检,实验结果讨论,思考题,微生物学实验,实验四、环境中微生物的分离与纯化,实验目的,学习、掌握微生物稀释分离、划线分离等技术,学习从样品中分离、纯化出所需菌株,学习掌握斜面接种技术,实验原理（略）,实验材料,菌源：土样,10g,培养基,无菌水：配置生理盐水，分装于锥形瓶中，每瓶装,90ml,，及玻璃珠，灭菌，待用。,其他物品：无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒、称量纸、药勺,微生物学实验,实验步骤,采土样：选择肥沃土壤,去表层土,挖,525cm,深度的土壤数,10g,装入已灭菌的牛皮纸袋,封好袋口,带回实验室。,倒平板（,8,个,/,组）,制备土壤稀释液：称取土样,10g,，放入盛,90ml,无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，摇,30min,。,取样：用无菌棉签沾取菌悬液，涂布于培养皿中某一处。（,4,个,/,皿）,用接种环从接种处划线分离。,贴标签，,37,倒置培养，,24h,。,实验结果与讨论,思考题,微生物学实验,实验五、细菌的革兰氏染色,实验目的,掌握革兰氏染色法的原理及操作步骤，观察细菌形态,掌握无菌操作和油镜的使用方法。,实验原理,G,菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫,-,碘复合物在细胞壁内。呈紫色。,G,菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫,-,碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。,微生物学实验,实验材料,1,菌种：大肠杆菌,、,枯草芽孢杆菌斜面（,37,下培养,10,小时左右）,2,染液：结晶紫染液、,95%,乙醇、碘液、番红染液、蒸馏水。,3,用具：载玻片、接种环、酒精灯、火柴、香柏油、乙醇乙醚混合液、擦镜纸、显微镜等。,实验步骤,涂片：将大肠杆菌（,Escherichia.coli,）、,枯草芽孢杆菌（,Bacillus.sub,）斜面,分别涂片、干燥、固定。,初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗,媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗,脱色：将水甩净，并衬以白背景，用,95%,乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约,2030,秒，立即用水冲净乙醇,复染：用番红液染,1-2,分钟，水洗,镜检,结果与讨论,思考题,微生物学实验,实验六、细菌的芽孢染色,实验目的,学习细菌的芽胞染色法,实验原理,细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。,微生物学实验,实验器材,菌：枯草杆菌（,Bacillus,subtilis,）、巨大芽包杆菌,染色液和试剂：,5%,孔雀绿水溶液、,0.5%,蕃红水溶液,器材：小试管（,75mm10mm,）、烧杯（,300mL,）、滴管、木夹、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。,实验步骤,孔雀绿染色法,制片：涂片、干燥、固定,滴孔雀绿染液于涂片中，加热至产生蒸汽达,35min,（加热时用木夹夹着载玻片，在火焰上方,23cm,处，或火焰附近，添加染液勿使图片干燥）,微生物学实验,水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。,复染：用蕃红液染色,12min,。,水洗、晾干或吸干。,镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。,石炭酸复红染色法,试管一支，加蒸馏水,34,滴，取,1-2,环芽孢杆菌于水中，并充分摇荡制成菌悬液。,滴加等量,34,滴石炭酸复红溶液摇匀，水浴煮沸,10min,以上。,取上述加热后的染色菌悬液,23,环于载玻片上制成涂片，然后经过干燥，火焰固定，水洗。,微生物学实验,美兰复染,12min,，经水洗，干燥后，镜检，绘图。,实验结果及讨论,绘出所用材料菌体的形态和芽胞的着生位置图。,思考题,微生物学实验,目的要求,观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；,掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。,基本原理,美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。,器材,菌种：,酿酒酵母（,Saccharomyces,cerevisiae,）培养约,2d,的马铃薯斜面培养物。,染色剂：,0.05,和,0.1,吕式碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液。,仪器或其他用具,：显微镜，载玻片，盖玻片等。,实验七、酵母菌形态的观察及死活菌的鉴定,微生物学实验,微生物学实验,操作步骤,美蓝浸片的观察,按无菌操作取少量酵母菌与,0.1,吕式碱性美蓝染色液混合均匀，放置约,3min,后，先用低倍镜后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并用颜色区别死活细胞。,染色,0.5h,后再次观察，注意死细胞是否增加。,用,0.05,美兰染液重复上述操作,观察酵母形态及出芽方式,实验结果及讨论,记录美兰浸片的观察结果；酵母形态及出芽方式；,思考题,微生物学实验,实验八、微生物细胞大小的测定,实验目的,了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。,实验原理,微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。,微生物学实验,n,1,n,2,微生物学实验,实验器材,活材料：酿酒酵母,(,Saccharomyces,cerevisiae,),斜面菌种、枯草杆菌,(,Baccillus,subtilis,),染色标本片。,器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、双层瓶、擦镜纸。,实验方法,镜测微尺的校正：在低倍镜和高倍镜下分别进行校正。,细胞大小的测定,移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定,1020,个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。,微生物学实验,实验结果及讨论,将实验结果填入下列表格,物镜,目尺格数,台尺格数,目尺校正值（m）,10,40,表1 目镜测微尺校正结果,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,平均值,长,宽,表2 酵母菌大小测定记录（格）,微生物学实验,结果计算,长m平均格数校正值,宽m平均格数校正值,大小表示：宽m长m,思考题,预习,:,实验,28,显微镜直接计数法,试验,29,平板菌落记数法,P90-94,微生物学实验,实验九,微生物细胞的显微直接计数法,目的要求,明确显微镜计数的原理,学习使用血球计数板进行微生物计数的方法,基本原理,微生物学实验,16,25 2516,0.1mm,3,400小格 n,1ml,?,微生物学实验,已知：1mL体积1000mm,3,所以：1mL体积应含有小方格数为,1000mm,3,(14000mm,3,)4x10,6,个小方格。即系数K4x10,6,。,因此：,每mL菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数(N)x系数(K)x菌液稀释倍数(d)。,微生物学实验,实验器材,活材料：酿酒酵母（,Saccharomyces,cerevisiae,）培养液。,器材：显微镜、血球计数板、移液管、吸耳球、盖玻片（,22mm22mm,）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。,实验方法,视待测菌悬液浓度，加无菌水进行,梯度稀释,至适当稀释，以每小格的菌数可数为度。,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,4.5ml,微生物学实验,取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。,将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。,静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。,微生物学实验,计数时若计数区是由,16,个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的,4,个中方格（即,100,小格）的菌数。如果是,25,个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央,l,个大方格的菌数（即,80,个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数右线不数左线，以减少误差。,对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数,3,次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（,N,），按公式计算出每,ml,（,g,）菌悬液所含酵母菌细胞数量。,测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存,。,微生物学实验,实验结果及讨论,取三次样，进行计数，最后算出每,mL,菌悬液中含有细胞数,思考题,预习实验二十九 平板菌落计数法,实验三十七 生物因素对微生物生长的影响,计数一次,每个中方格菌数,二室平均值,稀释倍数,菌数/ml,1,2,3,4,5,上室,下室,微生物学实验,实验十 平板菌落计数法,目的要求,了解稀释平板计数的原理,掌握涂抹平板培养法,认识细菌的菌落特征,基本原理,平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位,(colony-forming units,cfu,),而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。,微生物学实验,实验器材,活材料：大肠杆菌菌悬液,培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、,1,）,器材：,90ml,无菌水、,9ml,无菌水、无菌平皿、,lml,无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。,实验步骤,微生物学实验,操作步骤,9ml,4.5ml,1ml,0.5ml,0.1ml,10,-1,倒培养基、贴标签,0.5ml,0.5ml,0.5ml,4.5ml,4.5ml,4.5ml,4.5ml,4.5ml,10,-2,10,-3,10,-4,10,-5,10,-6,梯度稀释,取样,涂布,37倒置培养,计数,微生物学实验,注意事项：,梯度稀释：菌悬液必须摇匀,移液枪的使用：调刻度、取样、去除枪头,涂布操作,实验结果与讨论,稀释度,10,-4,10,-5,10,-6,菌落数,1,2,平均数,1,2,平均数,1,2,平均数,1ml样品活菌数,思考题,微生物学实验,实验十一 生物因素对微生物的影响,目的要求,了解某一抗生素的抗菌范围,学习抗菌谱试验的基本方法,基本原理,许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊的代谢产物,具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用,例如抗生素。不同抗生素的抗菌谱是不同的。,微生物学实验,器材,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌；,琼脂培养基,无菌平皿,接种环等。,操作步骤,将琼脂培养基溶化后,冷至,45,左右倒平板,凝固待用。,用接种环挑取抗生素滤纸条。,划线接种后,倒置于,37,温室中培养,1,天。,观察结果。,实验结果与讨论,绘图表示并说明实验用抗生素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效能。,思考题,微生物学实验,实验十二 用生长谱法测定微生物的营养要求,目的要求,学习用生长谱法测定微生物营养需要的基本原理和方法。,基本原理,为了使微生物生长、繁殖，必须供给所需要的碳源、氮源、无机盐、微量元素、生长因子等，如果缺少其中一种，微生物便不能生长。根据这一特性，可将微生物接种在一种只缺少某种营养物的完全合适的琼脂培养基中，倒成平板，再将所缺的营养物（例如各种碳源）点植于平板上，经适温培养，该营养物便逐渐扩散于植点周围。该微生物若需要此种营养物，便在这种营养物扩散处生长繁殖，微生物繁殖之处便出现圆形落圈，即生长图形，故称此法为生长谱法。这种方法可以定性、定量的测定微生物对各种营养物质的需要。在微生物育种和营养缺陷型的鉴定中也常用此法。,微生物学实验,实验器材,活材料：大肠杆菌菌悬液,培养基：合成培养基,器材：无菌平皿、镊子、记号笔、灭菌牙签等。,碳源：葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖、半乳糖、麦芽糖,操作步骤,将合成培养基约溶化后冷到,50,左右加入大肠杆菌悬液，摇匀，立即倾注于直径为,12,的无菌培养皿中，每组,2,个平皿，待充分凝固后，在平板背面用记号笔划分为三个区，并标明要点植的各种糖类，如图,1,所。,将无菌牙签，挑取,6,种糖对号点植，糖粒大小如小米粒。,倒置于,37,温室培养,18,24,小时，观察各种糖周围有无菌落圈。,实验结果及讨论,思考题,微生物学实验,实验十三 酸奶的制作及菌种的分离,目的要求,了解乳酸菌的生长特性及酸奶的制作方法,用划线分离法分离酸奶中的菌种,基本原理,指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌在自然界中种类很多，分布极广：有些种类生活在动物的肠、胃、口腔之中，皮肤表面以及乳、乳制品、肉类制品中；有的生存在水果、蔬菜、谷物及植物制品上。它们以单糖（葡萄糖、果糖、半乳糖）、双糖（蔗糖、麦芽糖、乳糖）为基质，代谢产物主要是乳酸。,微生物学实验,乳酸菌的作用已为医界所公认。据最近几年研究资料表明：乳酸菌作为定居肠道中的有益菌群具有多种保健作用：,1.,能维持微生态平衡和肠管机能。,2.,有抗菌作用，能抑制腐败菌。,3.,能改善肝功能。,4.,乳酸菌能使,5.,能增强免疫功能和抗肿瘤病。,微生物学实验,三、实验材料,酸奶，鲜牛奶，白糖，一次性杯子，保鲜袋,肉膏蛋白胨琼脂平板，无菌水，灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯或煤气灯，记号笔（或蜡笔），废物缸。,四、步骤,鲜奶煮沸,3,分钟后过滤，将过滤的牛奶迅速降温至,38,42,，在无菌下接种乳酸菌种，使菌种分布均匀。及时封口，在,37,士,1,恒温下发酵,24,小时，发酵后要检查酸度和凝固情况。,用划线分离法，用接种环从培养好的酸奶中挑取少量的培养液至肉膏蛋白胨琼脂平板中，在,37,士,1,恒温下培养,24,小时，反复多次划线，直至分出单个菌落。,对单菌落进行染色观察。,挑出单个菌落转接至斜面，培养，保存。,微生物学实验,